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专利号: 2016100732687
申请人: 广西大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 测量;测试
更新日期:2023-12-11
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种检测金黄色葡萄菌肠毒素A的方法,其特征是,该方法包括如下步骤:

1)将各DNA储备液在95℃ 下经加热处理5分钟,使用前,并在室温下放置30分钟,然后,分别取含3.0 μmol金黄色葡萄菌肠毒素A核酸适体Apt的杂交缓冲溶液40 μL和3.0 μmol信号探针ssDNA的杂交缓冲溶液40 μL 置于2ml 离心管中,在37℃下杂交1小时,生成金黄色葡萄菌肠毒素A核酸适体-信号探针杂交物 Apt - ssDNA;

2)在37℃下,分别将浓度为0~50 ng/mL的金黄色葡萄菌肠毒素A添加到Apt- ssDNA溶液中,金黄色葡萄菌肠毒素A与金黄色葡萄菌肠毒素A核酸适体反应,生成核酸适体-金黄色葡萄菌肠毒素A,释放出ssDNA;这时,体系中有ssDNA、剩余未反应的 Apt- ssDNA和核酸适体-金黄色葡萄菌肠毒素A物质;所述金黄色葡萄菌肠毒素A核酸适体为5’- AGCAGCACAG AGGTCAGATG TACTTATGCA TTTCCTCCCA CGATCTTATT TGAGAGTGAC CCTATGCGTG CTACC-3’;

3)加入10 μL 缓冲溶液,缓冲溶液组成为50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2,10 mM (NH4)2SO4,pH 7.5,然后加入10 mM dNTP 18 µL;再向体系中加入2µl 10 u/µl 的Phi29 DNA聚合酶, 在37℃下反应15分钟,使得以金黄色葡萄菌肠毒素A核酸适体-信号探针杂交序列 Apt-ssDN 为模板扩增成双链DNA,在65℃下保持10分钟使Phi29 DNA去活;

4)再向该反应体系中加入2μL 20 u/μL的Exo III核酸外切酶,在37℃下反应30分钟,Exo III核酸外切酶使选择性地催化双链DNA水解成单核苷酸,单链信号探针ssDNA不水解而保留下来;所述的单链信号探针ssDNA为5’-CCCCCCACACCCGATCCCCCCGGTAGCACGCATAGG-

3’;

5)向反应液中加入25 μL 1 mmol 硝酸银和10 mM,pH7.0的180μL PBS,然后,混合物在室温下避光或暗室中放置10分钟后,在快速搅拌下,加入100μL浓度为1 mM的新制备的抗坏血酸溶液,然后在45℃下反应5 ~10 min;

6)将溶液转移至微量比色皿,以波长为585 nm的光为激发光,测定体系荧光发射 610-

800 nm 光谱,体系的荧光发射峰的强度与金黄色葡萄菌肠毒素A存在线性关系,其线性方程式为,y = 286.87 +96.12 C,相关系数r = 0.9988,线性范围0.002~0.20 ng/mL,检测限1 pg/mL,回收率在97.5~114.3%,其它细菌毒素等生物小分子对金黄色葡萄菌肠毒素A的检测无干扰。

2.一种检测金黄色葡萄菌肠毒素A的试剂盒,其特征是,包括:金黄色葡萄菌肠毒素A核酸适体、单链信号探针ssDNA、DNA扩增体系、核酸外切酶、银离子还原检测体系,所述金黄色葡萄菌肠毒素A核酸适体为5’- AGCAGCACAG AGGTCAGATG TACTTATGCA TTTCCTCCCA CGATCTTATT TGAGAGTGAC CCTATGCGTG CTACC-3’ ;所述的单链信号探针DNA为5’-CCCCCCACACCCGATCCCCCCGGTAG CACGC ATAGG-3’ ;所述DNA扩增体系包括缓冲溶液 Tris-HCl、MgCl2、(NH4)2SO4 、三磷酸脱氧单核苷酸混合物dNTP和Phi29 DNA 聚合酶;所述核酸外切酶为Exo III核酸外切酶;所述的银离子还原检测体系中还原剂为抗坏血酸。

3.一种可用于检测金黄色葡萄菌肠毒素A的金黄色葡萄菌肠毒素A核酸适体,其碱基序列为5’- AGCAGCACAG AGGTCAGATG TACTTATGCA TTTCCTCCCA CGATCTTATT TGAGAGTGAC CCTATGCGTG CTACC-3’。