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专利号: 2016100801013
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-12-11
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种生物酶法合成(R)-2-羟酸的方法,其特征在于所述方法以重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂,以式(Ⅰ)所示外消旋2-羟酸为底物,以葡萄糖为辅助底物,以pH6.0~9.0缓冲液为反应介质构成反应体系,在20~50℃、150rpm条件下进行转化反应,反应完全后,将反应液分离纯化,获得(R)-2-羟酸;所述重组基因工程菌为含2-羟酸脱氢酶HADH基因、羰基还原酶KAR基因和葡萄糖脱氢酶GDH基因的重组大肠杆菌;所述2-羟酸脱氢酶HADH基因编码氨基酸序列为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.10之一所示;

式(Ⅰ)中:m(R)表示m个R基团,R为羟基、卤素或C1~C4烷基,m为0~2正整数;n为0~5个CH2。

2.如权利要求1所述生物酶法合成(R)-2-羟酸的方法,其特征在于所述2-羟酸脱氢酶HADH基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.9之一所示。

3.如权利要求1所述生物酶法合成(R)-2-羟酸的方法,其特征在于所述2-羟酸脱氢酶HADH基因编码氨基酸序列为SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.8之一所示。

4.如权利要求1所述生物酶法合成(R)-2-羟酸的方法,其特征在于所述羰基还原酶KAR基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.11所示。

5.如权利要求1所述生物酶法合成(R)-2-羟酸的方法,其特征在于所述葡萄糖脱氢酶GDH基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.13所示。

6.如权利要求1所述生物酶法合成(R)-2-羟酸的方法,其特征在于所述反应体系中,催化剂的用量以湿菌体重量计为20-60g/L,底物终浓度为10-30mM,辅助底物终浓度为10-

50mM。

7.如权利要求1所述生物酶法合成(R)-2-羟酸的方法,其特征在于所述重组基因工程菌按如下方法制备:将2-羟酸脱氢酶HADH基因连到表达载体pET28b构建质粒pET28b-HADH,再将羰基还原酶KAR基因和葡萄糖脱氢酶GDH基因与表达载体pETDuet-1连接构建质粒pCDFDuet-KAR-GDH;然后将质粒pET28b-HADH和质粒pCDFDuet-KAR-GDH转入大肠杆菌,筛选阳性克隆,获得含2-羟酸脱氢酶HADH基因、羰基还原酶KAR基因和葡萄糖脱氢酶GDH基因的重组大肠杆菌。

8.如权利要求1所述生物酶法合成(R)-2-羟酸的方法,其特征在于所述重组基因工程菌发酵培养方法为:将含2-羟酸脱氢酶HADH基因、羰基还原酶KAR基因和葡萄糖脱氢酶GDH基因的重组大肠杆菌接种到含50μg/mL链霉素和50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,于37℃、150转/分条件下振荡培养8~10h,获得种子液;将种子液按体积浓度2%接种量接入含

50μg/mL链霉素和50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,37℃、150转/分条件下振荡培养至OD600达到0.4~0.6时,加入IPTG至终浓度0.1mM,于28℃、150转/分条件下振荡培养10~

12h,将发酵液离心,取沉淀用生理盐水洗涤两次,离心,收集湿菌体。

9.如权利要求1所述生物酶法合成(R)-2-羟酸的方法,其特征在于所述反应温度为35℃。

10.如权利要求1所述生物酶法合成(R)-2-羟酸的方法,其特征在于所述反应体系中,催化剂的用量以湿菌体重量计为40g/L,底物终浓度为20mM,辅助底物终浓度为30mM。