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专利号: 2016101189912
申请人: 宁波大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-08-24
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种刺参ITGB基因,其特征在于该基因为SEQIDNO.1所示的cDNA序列。

2.一种权利要求1所述的刺参ITGB基因的克隆方法,其特征在于:根据与ITGB基因同源的表达序列标签EST序列设计基因特异性引物,采用RACE技术扩增基因全长,具体的步骤如下:(1)通过对灿烂弧菌诱导刺参血细胞cDNA文库的表达序列标签分析,发现了多条编码ITGB基因的表达序列标签序列,选取编码刺参ITGB部分片段的表达序列标签克隆;

(2)RACE引物设计:根据编码刺参ITGB部分片段的表达序列标签克隆设计RACE的巢式引物:3’上游特异性引物1:GGTTCATTGTCAAATCGGAG,3’上游特异性引物2:GATTACGTCGCTCTGGTCCA,5’下游特异性引物1:CCAACAATTCTGCAACCTCCG,

5’下游特异性引物2:TGCAACAAGGGGCACTTGGAG,扩增3’接头引物Adaptor3:TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT,扩增5’接头引物Adaptor5:CATGGCTACATGCTGACAGCCTA;

(3)RACE扩增获取ITGB基因全长序列,具体步骤如下:

a.总RNA提取:取刺参体腔液制备得到RNA提取液;

b.3’-RACE扩增:将RNA提取液用3’-Full RACE Core Set with PrimeScriptTMRTase试剂盒逆转录合成扩增3’的模板,以此为模板,使用3’上游特异性引物1和扩增3’接头引物进行PCR扩增,取PCR稀释后的产物1ul作为模板,再用3’上游特异性引物2和扩增3’接头引物进行PCR扩增得到3’端目的条带;

c.5’-RACE扩增:将上述RNA提取液用5’-Full RACE Kit试剂盒逆转录合成扩增5’的模板,具体合成方法依试剂盒说明书操作,以此为模板,使用5’下游特异性引物1和Adaptor5进行PCR扩增,取PCR产物稀释后1ul作为模板,再用5’下游特异性引物2和Adaptor5进行PCR得到5’端目的条带;

d.将上述扩增产物的目的条带用胶回收试剂盒回收,回收产物与载体pMD18-T连接,转化至大肠杆菌Escherichia coli DH5α后,在含有氨苄浓度为50μg/mL的LB平板培养基中培养8-12h,挑取阳性克隆菌落,进行RCR验证并送至上海生物工程有限公司测序,所得结果经DNAMAN软件分析拼接得刺参ITGB基因全长序列,其基因序列如SEQIDNO.1所示,其中LB平板培养基配方为胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L。

3.根据权利要求2所述的一种刺参ITGB基因的克隆方法,其特征在于RACE扩增反应体系:模板1.0μL,10×PCR缓冲液2.5μL,浓度25mM的MgCl2 2.0μL,浓度10mM的dNTP 2.0μL,浓度10μM的特异性引物1.0μL,浓度10μM的接头引物1.0μL,浓度5U/μL的DNA聚合酶0.2μL,超纯水:15.3μL;扩增条件:94℃3min、94℃30s、60℃30s、72℃1min,共35个循环,最后72℃延伸10min。

4.一种权利要求1所述的刺参ITGB基因的编码蛋白,其特征在于:该编码蛋白为SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。

5.一种刺参ITGB基因的重组工程菌的构建方法,其特征在于:具体步骤如下:(1)ITGB基因全长克隆及重组蛋白的构建与表达a.总RNA提取:取刺参体腔液制备得到RNA提取液;

b.cDNA合成:将上述RNA提取液用cDNA合成试剂盒逆转录合成cDNA,然后以合成的cDNA为模板,用分别含有BamH I位点和Not I位点的引物扩增刺参ITGB蛋白的编码基因,其蛋白序列如SEQIDNO.2所示,其中含BamH I位点ITGB上游扩增引物:GGATCCATGGCTGTGAGAACCCAGTT;

含Not I位点ITGB下游扩增引物:

GCGGCCGCTCATGTCATGCTGTCAACTAATG;

c.PCR扩增:cDNA 1.0μL,10×PCR缓冲液2.5μL,浓度25mM的MgCl2 2.0μL,浓度10mM的dNTP 2.0μL,浓度10μM的上游引物1.0μL,浓度10μM的下游引物1.0μL,浓度5U/μL的DNA聚合酶0.2μL,超纯水:15.3μL;扩增条件:94℃3min、94℃30s、60℃30s、72℃1min,共35个循环,最后72℃延伸10min;

d.PCR阳性克隆质粒:扩增反应后,用胶回收试剂盒回收PCR产物,然后回收产物与载体pMD18-T连接,转化至大肠杆菌Escherichia coli DH5α后,在含有氨苄浓度为50ug/mL的LB平板培养基中培养8-12h,挑取阳性克隆菌落,进行RCR验证和测序鉴定,得到正确的PCR阳性克隆质粒;

e.重组质粒:将PCR阳性克隆质粒用BamH I和Not I限制性内切酶双酶切,琼脂糖凝胶电泳回收分子量在30KDa的目的条带,与经同样酶切的pET28a(+)原核表达载体酶切产物连接,转化Escherichia coli DH5α,PCR筛选阳性克隆,经测序鉴定获得编码框正确的表达载体pET28a(+)-ITGB重组质粒;

f.重组蛋白的表达:将阳性重组质粒pET28a(+)-ITGB转化到表达宿主BL21(DE3),再接种到卡那霉素浓度为50ug/mL的LB培养液中,37℃、200r/min振荡培养至菌液OD600的值为

0.4-0.6时,加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷使其终浓度为1mmol/L,37℃诱导表达3-

6h,收集菌液,经12000r/min离心5min,弃上清液,获得细菌沉淀物;

(2)重组蛋白的纯化与复性

a、蛋白纯化:将100mL细菌沉淀物用10mL包涵体洗涤液重悬菌体,超声破碎菌体,

12000rpm离心10min,用5mL包涵体溶解液重悬沉淀,超声破碎,至溶液基本变清,再次

15000rpm离心20min,吸取1mL Ni-NTA SefinoseTMResin上柱,用无菌水洗两次,再用包涵体溶解液平衡一次;将上清液与之前上柱的Ni-NTA SefinoseTMResin混合,4℃混匀1h;将收集的流出液重复上柱2次,用杂蛋白洗涤液洗涤介质,每次10mL,洗脱10次后,加入0.6mL变性蛋白洗脱液洗脱,液体去尽;再加入1mL变性蛋白洗脱液洗脱,收集洗脱液,重复用1mL变性蛋白洗脱液洗脱五次,收集每次洗脱液合并,取少量洗脱液进行SDS-PAGE电泳鉴定,获得重组刺参ITGB蛋白;

b、蛋白复性:纯化后的重组刺参ITGB蛋白分别用透析液Buffer1、透析液Buffer2、透析液Buffer3透析,每步透析6-18h,最后,4℃12000r/min离心30min,收集沉淀,即为重组刺参ITGB蛋白。

6.根据权利要求5所述的一种刺参ITGB基因的重组工程菌的构建方法,其特征在于上述步骤(2)中,所述的包涵体洗涤液配方:2M尿素,20mM Tris-HCl,150mM NaCl,1mM EDTA,0.5%Triton×100,pH=7.9;

所述的包涵体溶解液配方为:8M尿素,20mM Tris-HCl,150mM NaCl,0.1%β-巯基乙醇,

0.2%Triton×100,30mM咪唑,pH=7.9;

所述的杂蛋白洗涤液配方为:6M尿素,1M Tris-HCl,2.5M NaCl,0.1%β-巯基乙醇,

0.1%Triton×100,2M咪唑,pH=7.9;

所述的变性蛋白洗脱液配方为:1.2M尿素,1M Tris-HCl,2.5M NaCl,2M咪唑,pH=4.5;

所述的透析液Buffer1配方为:1M Tris-HCl,2.5M NaCl,0.614g还原型谷胱甘肽,

0.0122g氧化型谷胱甘肽,2M咪唑,3M尿素,50mL甘油,50ul吐温-20,定容于1L,pH=7.9;

所述的透析液Buffer2配方为:1M Tris-HCl,2.5M NaCl,0.614g还原型谷胱甘肽,

0.0122g氧化型谷胱甘肽,2M咪唑,1M尿素,50mL甘油,50ul吐温-20,定容于1L,pH=7.9;

所述的透析液Buffer3配方为:1M Tris-HCl,2.5M NaCl,50mL甘油,定容于1L,pH=

7.9。

7.一种权利要求5-6中任一项所述的刺参ITGB基因的重组工程菌的应用,其特征在于:其表达的重组刺参β1-整合素对内毒素脂多糖、肽聚糖、甘露聚糖具有不同程度显著的结合作用,对内毒素脂多糖具有更强的结合活性,对肽聚糖、甘露聚糖的结合能力偏低。