1.测定肝微粒体中虫草素代谢物的液质联用方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)虫草素肝微粒体的温孵培养
在培养瓶中加入肝微粒体、NADP、NADH、G-6-P、G-6-P DH以及MgCl2后,补加三(羟甲基)氨基甲烷盐酸缓冲液配成肝微粒体孵育体系;在37℃全温振荡器温孵2-5min,再定量加入虫草素的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸缓冲液,开始反应,30min后将培养瓶从全温振荡器中取出,迅速加入冷的有机溶剂A终止代谢反应,得温孵产物;
2)样品处理
将温孵产物涡旋振荡30s,5000r/min离心10min,准确吸取上清液,在氮气下吹干后得残留物;残留物用甲醇复溶,涡旋振荡后,5000r/min离心10min,吸取上清液,上清液过0.22μm微孔滤膜后,进样10μL,进行液质检测;
3)样品分析
进行肝微粒体中虫草素代谢物测定,具体条件如下:色谱条件:
色谱柱:DiamonsilTM ODS C18;流动相:甲醇:水=15:85;洗脱时间:t=32min;进样量:
10μL;检测波长:λ=260nm;柱温:30℃;流速:0.5mL/min;
质谱条件:
一级质谱:电离模式:电喷雾电离(ESI);扫描模式:正离子扫描;电喷雾电压:4.0bar;
干燥气流速:10L/min;干燥气温度:200℃;
二级质谱:电离模式:电喷雾电离(ESI);扫描模式:正离子扫描;碰撞气:氮气;毛细管电压:2.8kV;锥孔电压:3.0V;源温度:110℃;脱溶剂温度:350℃;脱溶剂气体流量:10L/min;碰撞能量:15-25eV。
2.根据权利要求1所述的测定肝微粒体中虫草素代谢物的液质联用方法,其特征在于:所述步骤1)有机溶剂A为甲醇或乙腈,其加入量体积为反应体系的2-4倍。
3.根据权利要求1所述的测定肝微粒体中虫草素代谢物的液质联用方法,其特征在于:所述步骤3)中色谱柱型号为DiamonsilTM ODS C18,色谱柱250mm×4.6mm,5μm。
4.根据权利要求1所述的测定肝微粒体中虫草素代谢物的液质联用方法,其特征在于:步骤1)中三(羟甲基)氨基甲烷盐酸缓冲液的pH为7.4。
5.根据权利要求1所述的测定肝微粒体中虫草素代谢物的液质联用方法,其特征在于:步骤1)孵育体系中肝微粒体的浓度范围为2.0-4.0mg/mL、NADP的浓度范围为0.5-1.0mmol/L、NADH的浓度范围为0.5-1.0mmol/L、G-6-P浓度为10mmol/L、G-6-P DH的浓度范围为1.0-
2.0IU/mL、MgCl2的浓度为4.0mmol/L、虫草素的浓度范围为1.0-1.5mg/10mL。
6.根据权利要求1所述的测定肝微粒体中虫草素代谢物的液质联用方法,其特征在于:所述肝微粒体为小鼠、大鼠或人的肝微粒体。
7.根据权利要求1所述的测定肝微粒体中虫草素代谢物的液质联用方法,其特征在于:步骤1)中三(羟甲基)氨基甲烷盐酸缓冲液的浓度是50mmol/L。