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专利号: 2016103431323
申请人: 湖南科技学院
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种里氏木霉重组t-PA的分离纯化方法,其特征在于,包括以下步骤:将里氏木霉发酵制得的含有t-PA的粗酶液预处理后得到澄清液;

所述澄清液采用D296强阴离子交换树脂柱进行脱色,脱色后用磷酸缓冲液洗脱,得到洗脱液;所述D296强阴离子交换树脂柱的直径为1.5±0.2cm,长度为30±1cm;所述澄清液在D296强阴离子交换树脂柱中的线速度小于 0.5cm/min;

所述洗脱液采用硫酸铵进行盐析,盐析时,硫酸铵的添加量为:用硫酸铵调节所述洗脱液至饱和度为40%-50%;盐析后,在2-6℃,以7000-8000r/min 离心20-30min,得到沉淀;

将所述沉淀用磷酸缓冲液溶解,所述沉淀与所述磷酸缓冲液的质量比为1:4-6;然后进行透析脱盐;

脱盐后的酶液采用Q-Sepharose High Performance强离子交换色谱进行分离纯化,用磷酸缓冲液配置成的0-1mol/L的氯化钠进行梯度洗脱收集得到活性组分液;所述Q-Sepharose High Performance强离子交换色谱中的柱子的直径为2.6±0.2cm,长度为7±

1cm;流速为1.8-2.2 mL/min;

所述活性组分液经冷冻抽干即得t-PA成品;

所述盐析的温度为2-6℃,时间为7-9h;

所述透析脱盐采用透析袋进行,所述透析袋截留分子量为10000 Da;

上述步骤中使用的磷酸盐缓冲液的浓度均为0.018-0.022 mol/L,pH均为7.3-7.5。

2.根据权利要求1所述的分离纯化方法,其特征在于,盐析时,硫酸铵的添加量为:用硫酸铵调节所述洗脱液至饱和度为45%。

3.根据权利要求1所述的分离纯化方法,其特征在于,所述透析袋在使用前,先在0.9-

1.1mol/L EDTA溶液中煮沸8-15min,再在质量浓度为1.9%-2.1%的NaHCO3溶液中煮沸8-

12min,最后在蒸馏水中煮沸8-15min。