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专利号: 2016103546420
申请人: 河南大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 有机化学〔2〕
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种GFP-CD19融合蛋白,其特征在于,该蛋白包括776个氨基酸,分子量为85KD,其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述GFP-CD19融合蛋白的制备方法,其特征在于,该方法包括如下步骤:(1)以带有CD19 cDNA序列的质粒和带有GFP cDNA序列的质粒pET-28b-EGFP为模板,设计引物,进行PCR扩增,分别获得CD19分子的编码序列与GFP分子的编码序列;

PCR扩增CD19分子的基因序列时所采用引物序列如下:

上游引物:5’- AGGATCCgaggaacctctagtggtgaagg-3’,下游引物:5’- CAAGCTTtcacctggtgctccaggtgccc-3’;

PCR扩增GFP分子的基因序列时所采用引物序列如下:

上游引物:5’- GCATATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG -3’,下游引物:5’- AGGATCCCTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3’;

(2)将CD19基因序列和GFP基因序列分别与pGEM T-EASY载体连接,转化并筛选鉴定,获得正确的含有目的基因的pGEM-CD19质粒和pGEM-GFP质粒,进行测序验证;

(3)将pGEM-CD19质粒与原核表达载体pCold TF分别利用BamHI和HindIII进行双酶切,将CD19编码区连接进pCold TF,构建pCold-CD19载体;

(4)将所构建pCold-CD19载体与pGEM-GFP质粒分别利用NdeI和BamHI进行双酶切,将GFP编码区连接进pCold-CD19,构建重组表达载体pCold TF-GFP-CD19;

(5)将重组表达载体pCold TF-GFP-CD19转化BL21感受态细胞,IPTG诱导表达重组蛋白GFP-CD19;

(6)诱导表达结束后,裂解菌体,采用Ni-NTA亲和色谱法纯化获得GFP-CD19融合蛋白。

3.权利要求1所述GFP-CD19融合蛋白在细胞标记中的应用,其特征在于,用于标记细胞表面表达有CD19抗体的转染后T淋巴细胞。