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专利号: 201610438016X
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-12-11
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种酶法不对称还原柠檬醛提高(R)-香茅醛光学纯度的方法,其特征在于所述方法为:以含酿酒酵母烯醇还原酶OYE1编码基因的工程菌发酵培养获得的湿菌体经超声破碎、分离纯化获得的纯酶为催化剂,以含博伊丁假丝酵母甲酸脱氢酶FDHCB编码基因的工程菌发酵培养获得的湿菌体经超声破碎、分离纯化获得的纯酶为偶联酶,以柠檬醛为底物,以仲辛醇为溶剂,以甲酸钠为辅底物,以NAD+为辅酶,添加氨基酸,以pH 6.0~9.5的缓冲液为反应介质构成转化体系,在30℃、200rpm条件下进行转化反应,反应完全后,获得(R)-香茅醛;

所述酿酒酵母烯醇还原酶OYE1编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示,所述博伊丁假丝酵母甲酸脱氢酶FDHCB编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示。

2.如权利要求1所述酶法不对称还原柠檬醛提高(R)-香茅醛光学纯度的方法,其特征在于所述转化体系中,底物以1M底物仲辛醇溶液的形式加入,底物终浓度为50mM,催化剂用量为0.76U/mL,偶联酶用量为1.25U/mL,NAD+终浓度为0.625mM,甲酸钠终浓度为250mM,氨基酸终浓度为100mg/mL。

3.如权利要求1所述酶法不对称还原柠檬醛提高(R)-香茅醛光学纯度的方法,其特征在于所述氨基酸为下列之一:D-蛋氨酸、L-蛋氨酸、D/L-缬氨酸、甘氨酸、L-丝氨酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-赖氨酸和L-酪氨酸。

4.如权利要求1所述酶法不对称还原柠檬醛提高(R)-香茅醛光学纯度的方法,其特征在于所述氨基酸为甘氨酸。

5.如权利要求1所述酶法不对称还原柠檬醛提高(R)-香茅醛光学纯度的方法,其特征在于所述缓冲液为pH 7.0、50mM的PIPES缓冲液。

6.如权利要求1所述酶法不对称还原柠檬醛提高(R)-香茅醛光学纯度的方法,其特征在于所述催化剂按如下方法制备:(1)将含酿酒酵母烯醇还原酶OYE1编码基因的工程菌接种于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中,在37℃和200rpm条件下培养12h,作为种子液;然后按体积浓度1%接种量接种至含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中,在37℃和

200rpm条件下培养至OD600为0.6~0.8时,添加诱导剂IPTG至终浓度为0.2mM,在25℃和

200rpm下继续培养10~12h,培养液离心,收集湿菌体;

(2)将步骤(1)湿菌体用pH 8.0、Tris-HCl缓冲液悬浮,在500W下超声破碎20min,工作

2s,间歇6s,破碎液于4℃和10000rpm下离心10min,重复离心三次后得到上清粗酶液;采用Ni-NTA金属螯合亲和层析,取上清粗酶液上样至预平衡Ni2+柱中,再依次用含10mM咪唑、

40mM咪唑、100mM咪唑、250mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱杂蛋白和目的蛋白,收集含有100mM咪唑的洗脱缓冲液的流出液,用50mM、pH 8.0的Tris-HCl缓冲液通过超滤浓缩脱盐,所得的脱盐酶液,即为酿酒酵母烯醇还原酶OYE1纯酶;所述洗脱缓冲液为含300mM氯化钠的pH 8.0、

50mM的Tris-HCl缓冲液。

7.如权利要求1所述酶法不对称还原柠檬醛提高(R)-香茅醛光学纯度的方法,其特征在于所述偶联酶按如下方法制备:(1)将含博伊丁假丝酵母甲酸脱氢酶FDHCB编码基因的工程菌接种于含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,在37℃和200rpm条件下培养12h,作为种子液;然后按体积浓度1%接种量接种至含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,在37℃和200rpm条件下培养至OD600为0.6~0.8时,添加诱导剂IPTG至终浓度为0.2mM,在25℃和

200rpm下继续培养10~12h,培养液离心,收集湿菌体;

(2)将步骤(1)湿菌体用pH 8.0、Tris-HCl缓冲液悬浮,在500W下超声破碎20min,工作

2s,间歇6s,破碎液于4℃和10000rpm下离心10min,重复离心三次后得到上清粗酶液;采用Ni-NTA金属螯合亲和层析,取上清粗酶液上样至预平衡Ni2+柱中,再依次用含10mM咪唑、

40mM咪唑、100mM咪唑、250mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱杂蛋白和目的蛋白,收集含有100mM咪唑的洗脱缓冲液的流出液,用50mM、pH 8.0的Tris-HCl缓冲液通过超滤浓缩脱盐,所得的脱盐酶液,即为甲酸脱氢酶FDHCB纯酶;所述洗脱缓冲液为含300mM氯化钠的pH 8.0、50mM的Tris-HCl缓冲液。