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专利号: 2016105554046
申请人: 青岛大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 测量;测试
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种兼备目标物的识别与电化学信号产生功能的探测靶生物分子的生物探针,其特征是:该生物探针包括纳米银和若干连接在纳米银表面的探针本体,所述探针本体包含有对目标物具有特异性识别功能的核酸适体片段和与该核酸适体片段形成部分碱基互补序列的核酸片段,所述核酸适体片段与所述核酸片段杂交形成所述探针本体,其中所述核酸片段3’端硫醇化;所述核酸片段竞争性杂交所述核酸适体片段的能力弱于所述目标物杂交核酸适体片段的能力。

2.权利要求1所述的生物探针的制备方法,其特征是:包括以下步骤:将打开二硫键的所述核酸片段与核酸适体片段互补配对,形成探针本体溶液;将所述探针本体溶液与纳米银胶体混合反应,得到探测靶生物分子的生物探针。

3.如权利要求2所述的制备方法,其特征是:打开二硫键的所述核酸片段是由以下方法得到:将所述核酸片段与含有三(2-羧乙基)膦的溶液进行反应打开二硫键,得到打开二硫键的所述核酸片段;

优选的,所述探针本体溶液的具体反应步骤为:在35~40℃反应1.5~2.5小时;

优选的,所述混合反应的条件为:密封避光,在35~40℃搅拌反应5~6h,并在2~6℃反应10~14h;

进一步优选的,在2~6℃反应10~14h后,在搅拌条件下向反应物中加入PBS缓冲液调节pH,再加入NaCl溶液,密封避光搅拌2~4h,密封避光2~6℃反应10~24h后用PBS离心洗涤,得到探测靶生物分子的生物探针。

4.一种包含权利要求1所述的生物探针的电化学生物传感器,其特征是:是由以下方法制备得到:所述探测靶生物分子的生物探针在目标物的引发下,通过竞争反应,所述核酸适体片段脱离所述探针本体并与目标物特异性结合;

加入EXO I酶,EXO I酶水解所述单链形式存在的核酸适体片段,此时目标物游离并继续与所述探针本体中的核酸适体片段特异性结合,形成水解和特异性结合的目标信号放大的循环反应,最终得到连接所述核酸片段的纳米银;

加入互补探针,所述互补探针包括纳米银和若干连接在纳米银表面的并与所述核酸片段碱基互补的核酸片段,其中,该核酸片段3’端硫醇化;

利用碱基互补配对原理,得到的与所述互补探针碱基互补后的纳米银在修饰有所述互补探针DNA的金电极表面聚集,得到的金电极即为电化学生物传感器。

5.如权利要求4所述的电化学生物传感器,其特征是:所述互补探针是由以下制备方法制备得到:将打开二硫键的与所述核酸片段碱基互补的核酸片段与纳米银胶体混合反应,得到互补探针;优选的,打开二硫键的与所述核酸片段碱基互补的核酸片段是由以下方法制备得到:将与所述核酸片段碱基互补的核酸片段与含有三(2-羧乙基)膦的溶液进行反应打开二硫键,得到打开二硫键的与所述核酸片段碱基互补的核酸片段;

优选的,所述混合反应的条件为:密封避光,在35~40℃搅拌反应5~6h,并在2~6℃反应10~14h;

进一步优选的,在2~6℃反应10~14h后,在搅拌条件下向反应物中加入PBS缓冲液调节pH,再加入NaCl溶液,密封避光搅拌2~4h,密封避光2~6℃反应10~24h后用PBS离心洗涤,得到互补探针。

6.权利要求4或5所述的电化学生物传感器在检测生物分子浓度的应用。

7.如权利要求6所述的应用,其其特征是:所述生物分子包括ATP、氨基酸、核苷酸、毒素、酶、生长因子、细胞黏附分子、病毒、细菌和细胞或其他能作为适体筛选的生物分子。

8.如权利要求6或7所述的应用,其特征是,所述应用方法包括以下步骤:

(1)电化学检测:将各个标准浓度的目标物的电化学生物传感器进行LSV检测,得到不同标准浓度目标物的LSV峰电流;

(2)标准曲线的绘制:将步骤(1)中的LSV峰电流对目标物浓度的对数做线性回归方程,得到该方法的标准曲线;

(3)实际样品的检测:取实际样品的电化学传感器进行电化学检测得到相应的LSV峰电流,将LSV峰电流代入步骤(2)中标准曲线,得到实际样品中的目标物的浓度。

9.如权利要求8所述的应用,其特征是,LSV检测条件为:以金电极为工作电极,甘汞电极为参比电极,铂丝电极为对比电极构成三电极系统进行LSV检测。

10.如权利要求9所述的应用,其特征是:LSV检测液为PBS缓冲液。