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专利号: 2016105801772
申请人: 江南大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-10-11
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种具有转糖苷活性耐热β-半乳糖苷酶突变体,其特征在于该突变体是通过对β-半乳糖苷酶BgaB催化氨基酸位点E303由原谷氨酸(Glu)定点突变为半胱氨酸(Cys),再将半胱氨酸巯基氧化为-SOO-所得;所述β-半乳糖苷酶为嗜热脂肪芽孢杆菌来源的耐热β-半乳糖苷酶BgaB。

2.一种转糖苷活性耐热β-半乳糖苷酶突变体的制备方法,其特征在于该制备方法的步骤如下:A、突变体酶的构建

以含有嗜热脂肪芽孢杆菌来源的耐热β-半乳糖苷酶BgaB基因的质粒pKK223-3-bgaB为模板,以全质粒扩增突变法对E303位点进行定点突变,将谷氨酸(Glu)突变为半胱氨酸(Cys),得到突变体E303C;

B、突变体酶的表达与纯化

将全质粒扩增得到的定点突变PCR片段经胶回收及双酶切后,与pKK223-3载体的双酶切产物进行连接,转化至大肠杆菌JM109感受态细胞;挑取重组菌单克隆接种于5mL LB抗性培养基中,37℃下培养过夜,按以体积比计1%接种量将种子液接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中,37℃振荡培养,当OD600达到0.6~1.0时,加入诱导剂IPTG,20℃过夜诱导表达后,对发酵液进行离心,去上清、收集菌体,再以5~10倍体积磷酸缓冲液重悬,加入蛋白酶抑制剂后进行超声波破壁,得到破胞液;将破胞液进行热处理去除不耐热的杂蛋白后,离心收集上清液,得到粗酶液;

将上述粗酶液用镍亲和柱纯化分离后收集洗脱液,然后用50mM pH7.0磷酸缓冲液透析去除咪唑,再用聚乙二醇包埋浓缩制得未经氧化的突变体酶;

C、突变体酶的氧化

将步骤B得到的突变体酶进行氧化处理,氧化反应体系为0.25M pH6.5磷酸盐缓冲溶液

100μL、0~300mM KI溶液、10μM Br、3μM突变体酶,在温度25℃条件下处理30h,得到所述β-半乳糖苷酶突变体。

3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于步骤A中扩增引物为:

E303C上游引物:

5’-GTCAACCGTTTATTTTGATGTGCCAGGTAACCTCACATGTTAA-3’E303C下游引物:

5’-TTAACATGTGAGGTTACCTGGCACATCAAAATAAACGGTTGAC-3’PCR反应条件为:94℃预变性2min;95℃变性30s;63℃~65℃30s;68℃7min,进行16个循环,最后68℃延伸15min;

PCR反应体系为:dNTPs(2mM)5μL、10×KOD plus Buf.5μL、KOD plus 1μL、MgSO4 2μL、上游引物1.5μL、下游引物1.5μL、模板1μL、去离子水33μL,总体积50μL。

4.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于步骤B中超声波破壁的工作条件为:功率400W,总破壁时间为30min,其中超声破壁工作1s,停止9s。

5.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于步骤B中,用镍亲和柱纯化分离后收集洗脱液的过程如下:向4mL镍亲和柱加入5倍柱体积去离子水至柱顶端自然洗脱后用2~3倍体积的Binding buffer自然洗脱;再将经0.22μm滤膜过滤的粗酶液上柱,慢流使样品与柱充分结合,待样品流干后分别用6倍柱体积的Washing buffer连续梯度洗脱洗脱杂蛋白质,最后用4倍Elution buffer洗脱目的蛋白,收集洗脱液;

所述Binding buffer含20mM咪唑;所述Washing buffer分别含咪唑20mM、80mM、100mM;

所述Elution buffer含250mM咪唑。

6.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于步骤C中KI溶液为200-300mM。

7.权利要求1所述的转糖苷活性耐热β-半乳糖苷酶突变体或根据权利要求2-6中任一项制备方法得到的转糖苷活性耐热β-半乳糖苷酶突变体在生产低聚半乳糖中的用途。