1.一种肠炎沙门氏菌疫苗,其特征在于,其组分包括双基因缺失肠炎沙门氏菌;所述双基因为rfaH基因和sopB基因,采用同源重组方法和蔗糖敏感基因的负筛选方法对所述肠炎沙门氏菌中的rfaH基因和sopB基因进行敲除。
2.根据权利要求1所述肠炎沙门氏菌疫苗,其特征在于,所述rfaH基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示,所述sopB基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。
3.根据权利要求1所述肠炎沙门氏菌疫苗,其特征在于,所述采用同源重组方法和蔗糖敏感基因的负筛选方法具体包括如下步骤:
1)根据肠炎沙门氏菌的基因组序列,设计出rfaH基因的上游同源臂序列rU的上游引物rfaH-1F和下游引物rfaH-1R,rfaH基因的下游同源臂序列rD的上游引物rfaH-2F和下游引物rfaH-2R,所述rfaH-1F的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示,所述rfaH-1R的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示,所述rfaH-2F的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示,所述rfaH-2R的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示;
2)采用PCR扩增方法,以肠炎沙门菌的基因组DNA为模板,以rfaH-1F和rfaH-1R为引物扩增得到rfaH的上游同源臂rU,以rfaH-2F和rfaH-2R为引物扩增得到rfaH的下游同源臂rD;
3)以步骤2)扩增得到的rU和rD为模板,rfaH-1F和rfaH-2R为引物,进行交叠PCR反应,获得交叠PCR产物rUD;
4)将步骤3)得到的交叠PCR产物rUD与pMD19-T载体进行连接,将连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,采用蓝白筛选和氨苄青霉素抗性筛选挑选阳性克隆,采用LB培养基培养挑选出的阳性克隆,提取质粒,获得重组pMD-△rfaH质粒;
5)用限制性内切酶BglⅡ分别酶切自杀质粒pYG4和重组pMD-△rfaH质粒,回收自杀质粒pYG4酶切后获得的5797bp片段和重组pMD-△rfaH质粒酶切后获得的1885bp片段,将获得的5797bp片段和1885bp片段于金属浴中连接过夜;
6)将步骤5)连接后的产物热激转化大肠杆菌S17-l/λpir感受态细胞,对转化后的细胞进行培养,将培养菌液涂布于卡拉霉素抗性LB平板上,挑取单菌落,增菌后提取质粒,获得重组自杀质粒pYG4-ΔrfaH;
7)在含有萘啶酸的LB培养基中培养受体菌肠炎沙门氏菌,在含有卡拉霉素的LB培养基中培养供体菌含重组自杀质粒pYG4-ΔrfaH的大肠杆菌S17-l/λpir,对所述受体菌和供体菌培养后分别收集菌体并重悬,将重悬后的供体菌和受体菌混合并于无抗生素的LB培养基上培养,将培养得到的菌液涂布于含卡那霉素和萘啶酸的双抗平板上,筛选阳性克隆单整合菌株,将筛选得到的单整合菌株于无抗生素的LB培养基中培养后,用蔗糖平板筛选,得到发生染色体内重组的肠炎沙门氏菌株;以序列如SEQIDNO.7所示的rfaH-1和序列如SEQIDNO.8所示的rfaH-2为引物,采用PCR方法对发生染色体内重组的肠炎沙门氏菌株进行筛选鉴定,挑选PCR扩增出631bp的菌株,得到敲除rfaH基因的肠炎沙门氏菌株;
8)根据肠炎沙门氏菌的基因组序列,设计出sopB基因的上游同源臂序列sU的上游引物sopB-1F和下游引物sopB-1R,sopB基因的下游同源臂序列sD的上游引物sopB-2F和下游引物sopB-2R,所述sopB-1F的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示,所述sopB-1R的核苷酸序列如SEQIDNO.10所示,所述sopB-2F的核苷酸序列如SEQIDNO.11所示,所述sopB-2R的核苷酸序列如SEQIDNO.12所示;
9)采用PCR扩增方法,以肠炎沙门菌的基因组DNA为模板,以sopB-1F和sopB-1R为引物扩增得到sopB的上游同源臂sU,以sopB-2F和sopB-2R为引物扩增得到sopB的下游同源臂sD;
10)以步骤9)扩增得到的sU和sD为模板,sopB-1F和sopB-2R为引物进行交叠PCR反应,获得交叠PCR产物sUD;
11)将步骤10)得到的交叠PCR产物sUD与pMD19-T载体进行连接,将连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,采用蓝白筛选和氨苄青霉素抗性筛选挑选阳性克隆,采用LB培养基培养挑选出的阳性克隆,提取质粒,获得重组pMD-△sopB质粒;
12)用限制性内切酶BglⅡ分别酶切自杀质粒pYG4和重组pMD-△sopB质粒,回收自杀质粒pYG4酶切后获得的5797bp片段和重组pMD-△sopB质粒酶切后获得的1917bp片段,将获得的5797bp片段和1917bp片段于金属浴中连接过夜;
13)将步骤12)连接后的产物热激转化大肠杆菌S17-l/λpir感受态细胞,对转化后的细胞进行培养,将培养菌液涂布于卡拉霉素抗性LB平板上,挑取单菌落,增菌后提取质粒,获得重组自杀质粒pYG4-ΔsopB;
14)在含有萘啶酸的LB培养基中培养受体菌步骤7)得到的敲除rfaH基因的肠炎沙门氏菌株,在含有卡拉霉素的LB培养基中培养供体菌含重组自杀质粒pYG4-ΔsopB的大肠杆菌S17-l/λpir,对所述受体菌和供体菌培养后分别收集菌体并重悬,将重悬后的供体菌和受体菌混合并于无抗生素的LB培养基上培养,将培养得到的菌液涂布于含卡那霉素和萘啶酸的双抗平板上,筛选阳性克隆单整合菌株,将筛选得到的单整合菌株于无抗生素的LB培养基中培养后,用蔗糖平板筛选,得到发生染色体内重组的肠炎沙门氏菌株;以序列如SEQIDNO.13所示的sopB-1和序列如SEQIDNO.14所示的sopB-2为引物,采用PCR方法对发生染色体内重组的肠炎沙门氏菌株进行筛选鉴定,挑选PCR扩增出379bp的菌株,得到缺失rfaH基因和sopB基因的双基因缺失肠炎沙门氏菌菌株。
4.根据权利要求1所述肠炎沙门氏菌疫苗,其特征在于,所述疫苗为口服疫苗。
5.根据权利要求1所述肠炎沙门氏菌疫苗,其特征在于,所述双基因缺失肠炎沙门氏菌在所述疫苗中的浓度为1×107CFU/0.1mL。