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专利号: 2016108808612
申请人: 齐鲁工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种快速检测细菌是否产多糖的方法,其特征在于:提取待检测海洋细菌的总DNA,利用特异性引物对(GF,GR)和特异性引物对(FP1,FP2)进行PCR扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测,若能扩增出1230bp和600bp的条带,则表明该带检测海洋细菌具有产多糖的能力,若即不能扩增出1230bp的条带也不能扩增出600bp的条带,则表明该带检测海洋细菌不具备产多糖的能力;

所述特异性引物对(GF,GR)的核苷酸序列如下所示:

GF:5’-ATGAATAAGTTTTGTATTGTCATTCAA-3’;

GR:5’-TTAACGGCCATAACGTGTCTTT-3’;如SEQ ID NO.1、2所示;

所述特异性引物对(FP1,FP2)的核苷酸序列如下所示:

FP1:5’-GCCCCTACATGCTGAAGAACA-3’;

FP2:5’-CGAGCAAGGCGCTTCCT-3’;如SEQ ID NO.3、4所示。

2.根据权利要求1所述的快速检测细菌是否产多糖的方法,其特征在于:对于特异性引物对(GF,GR),PCR扩增体系为:10×PCR Buffer,2.5μL;Mg2+,1μL;dNTP,0.5μL;GF(10mmol/L),0.8μL;GR(10mmol/L),0.8μL;DNA,0.8μL;Taq酶,0.5μL;dH2O,补足至25μL。

3.根据权利要求1所述的快速检测细菌是否产多糖的方法,其特征在于:对于特异性引物对(FP1,FP2),PCR扩增体系为:10×PCR Buffer,2.5μL;Mg2+,1μL;dNTP,0.5μL;FP1(10mmol/L),0.8μL;FP2(10mmol/L),0.8μL;DNA,0.8μL;Taq酶,0.5μL;dH2O,补足至25μL。

4.根据权利要求1或2所述的快速检测细菌是否产多糖的方法,其特征在于:对于特异性引物对(GF,GR),PCR扩增条件为:94℃5min;94℃30s,51℃30s,72℃2min,35cycle;72℃

10min。

5.根据权利要求1或3所述的快速检测细菌是否产多糖的方法,其特征在于:对于特异性引物对(FP1,FP2),扩增条件为94℃5min;94℃30s,55℃30s,72℃1min,35cycle;72℃

10min。

6.根据权利要求1~5中任一项所述的快速检测细菌是否产多糖的方法,其特征在于:还包括以下步骤:对上述检测到扩增产物的待检测细菌,进行荧光定量PCR扩增检测,荧光定量PCR引物如下:SGF:5’-CCACCAAAAGCAACAGCAC-3’;

SGR:5’-CAAAACGAAGTGGGGCTAAA-3’;如SEQ ID NO.5、6所示;

以16S rDNA为内参基因,引物序列为:

16S rDNA-F:5’-TGTCTACGGACCAAAGGG-3’;

16S rDNA-R:5’-CTGCTGGCACGGAGTTAG-3’;如SEQ ID NO.7、8所示;

扩增完后使用荧光定量PCR仪Rotor-Gene Q自带软件进行相对表达量的分析。

7.根据权利要求6所述的快速检测细菌是否产多糖的方法,其特征在于:所述PCR扩增体系为:SYBR Green Real-time PCR Master Mix,12.5μL;SGF(10mmol/L),0.5μL;SGR(10mmol/L),0.5μL;dH2O,9.5μL;cDNA,2μL。

8.根据权利要求6或7所述的快速检测细菌是否产多糖的方法,其特征在于:所述PCR扩增条件为:95℃30s;95℃5s,54℃30s,72℃30s,50cycle;溶解曲线70℃~99℃。