1.一种鉴别三种药用白及的色谱指纹图谱方法,其特征在于,包括如下步骤:(1):预处理
将按照统计学方法取样得到的已知不同品种的药用白及材料切成薄片后混合,于60-
70℃的烘箱中烘干至恒重并粉碎成粉末;
(2):多糖提取
①采用80℃-90℃的无水乙醇索氏提取步骤(1)中所得粉末至回流液无色,挥干溶剂,将所得白及药渣按照料液比(1-2):(4-6)加入蒸馏水中,并于75℃-85℃水浴冷凝回流提取
3-5次,每次2-3h;
②合并滤液并向滤液中添加质量分数为0.3%-0.5%的活性炭混匀脱色,于60℃-65℃环境下静置1-2h后抽滤;
③抽滤后,将上述溶液于60℃-65℃在旋转蒸发仪进行负压浓缩为原体积的30%-
35%,再加入无水乙醇,使其终浓度达到80%-85%v/v,再于3-5℃冰箱中静置2-3h,接着,
3000-4000r/min转速下离心10-20min后留取沉淀;
④将沉淀用蒸馏水溶解即得药用白及粗多糖溶液;
(3):多糖纯化
对步骤(2)所得的粗多糖溶液进行进一步的多糖纯化;
(4):色谱指纹图谱的建立
①将不同分子量的葡聚糖标准品配置成4-5mg/mL的水溶液分别进样于高效体积排阻色谱HPSEC中,再根据各相应色谱图计算多糖分子量标准曲线方程;
②多糖纯化后的药用白及样品分别进样于高效体积排阻色谱HPSEC,获取相应色谱图,再根据多糖分子量标准曲线方程计算出各样品的色谱曲线各部分的相对分子量,最终建立相应已知的药用白及样品的HPSEC代表模式色谱图谱;
(5):未知种类白及的鉴定
将未知种类的白及按照以上步骤(1)-(4)进行处理,以得到其对应色谱指纹图谱,再将其与已建立的已知的白及样品的色谱指纹图谱进行相似度比较,当其相似度大于90%以上时,即可判定为同一类白及属植物,否则不是同一种属。
2.根据权利要求1所述的一种鉴别三种药用白及的色谱指纹图谱方法,其特征在于,所述步骤(1)中不同品种药用白及的品种分别为:紫花三叉白及、黄花白及与小白及。
3.根据权利要求1所述的一种鉴别三种药用白及的色谱指纹图谱方法,其特征在于,所述步骤(1)中药用白及材料为药用白及鲜品块茎或干燥块茎。
4.根据权利要求1所述的一种鉴别三种药用白及的色谱指纹图谱方法,其特征在于,所述步骤(1)中统计学方法为:分别在贵州、云南、四川、安徽四个地区按照五点取样法收集药用白及样本。
5.根据权利要求1所述的一种鉴别三种药用白及的色谱指纹图谱方法,其特征在于,所述步骤(3)中多糖纯化采用Sevage法:按照样品与萃取剂体积比(3-5):(0.5-2)加入Sevage试剂,混匀,振荡25-35min,以3000-4000r/min离心5-10min,弃去除下层氯仿及中层变性蛋白;再取上层水溶液重复去蛋白操作,至无明显中层为止;最后,收集去蛋白后的上层水溶液,通过超滤装置超滤,脱去小分子物质,即得到纯化后的多糖浓缩溶液。
6.根据权利要求5所述的一种鉴别三种药用白及的色谱指纹图谱方法,其特征在于,所述Sevage试剂为体积比分别为(3-5)∶(0.5-1.5)的氯仿与正丁醇的混合液。
7.根据权利要求5所述的一种鉴别三种药用白及的色谱指纹图谱方法,其特征在于,所述超滤装置为滤膜截留分子量为1K的超滤装置。
8.根据权利要求1所述的一种鉴别三种药用白及的色谱指纹图谱方法,其特征在于,所述步骤(4)中不同分子量的葡聚糖标准品的重均分子量Mw分别为:2000KDa、580KDa、70KDa、
10KDa、5KDa。
9.根据权利要求1所述的一种鉴别三种药用白及的色谱指纹图谱方法,其特征在于,所述步骤(4)中多糖分子量标准曲线方程的计算方法为:根据各葡聚糖标准品的色谱峰保留时间和分子量对数,以标准品的分子量对数lgMw为纵坐标,色谱峰保留时间Rt为横坐标,使用线性方程拟合得多糖分子量标准曲线方程。
10.根据权利要求1-9任一所述的一种鉴别三种药用白及的色谱指纹图谱方法,其特征在于,进行高效体积排阻色谱HPSEC检测时相应色谱条件为:流动相为0.1M醋酸钠,流速为
0.5mL/min,柱温为45℃,进样量为20μL。