1.一种靶向wnt信号通路溶瘤腺病毒的构建方法,包括以下步骤:
1)将TCF/LEF启动子插入pXC2-Δ24中,再连接到pshuttle中,构建成pshuttle-TCF/LEF-E1A(Δ24),经Kpn Ⅰ酶切后得到线性化处理的pshuttle-TCF/LEF-E1A(Δ24);
2)从质粒pcDNA3-hygro上获得TSLC1基因,将得到的TSLC1基因与pMD18-T-Vector连接,得到TSLC1连接产物,将所述TSLC1连接产物与DH5α感受态细胞混合,得到重组质粒T-TSLC1,所述重组质粒T-TSLC1经Kpn Ⅰ酶切后,得到TSLC1片段;
3)将所述步骤1)得到的线性化处理的pshuttle-TCF/LEF-E1A(Δ24)与所述步骤2)得到的TSLC1片段经连接酶连接后,得到pshuttle-TCF/LEF-E1A(Δ24)-TSLC1;
4)将所述步骤3)得到的pshuttle-TCF/LEF-E1A(Δ24)-TSLC1经Pme Ⅰ线性化转化到含有全序列腺病毒骨架DNA的质粒pAdeasy-1大肠杆菌BJ5183中重组,产生E1A区由TCF/LEF启动子控制代替E1A内源启动子的以及缺失E1A-CR2区的24碱基的腺病毒骨架DNA质粒;
5)将所述步骤4)得到的腺病毒骨架DNA质粒用pac Ⅰ酶切线性转化后,转染到293A细胞中进行病毒包装,待细胞出现病变后,得到目的溶瘤腺病毒Ad.wnt-E1A(Δ24)-TSLC1;
所述步骤1)和步骤2)没有时间顺序限制。
2.根据权利要求1所述的靶向wnt信号通路溶瘤腺病毒的构建方法,其特征在于,所述步骤1)中需要对pshuttle-TCF/LEF-E1A(Δ24)进行鉴定,所述pshuttle-TCF/LEF-E1A(Δ24)鉴定的PCR体系为:所述步骤1)得到的pshuttle-TCF/LEF-E1A(Δ24)1μl、TSLC1 sence引物2μl、TSLC1 antisence引物2μl、10×Buffer 5μl、MgSO4 4μl、dNTP 1μl、KOD酶1μl和ddH2O 35μl。
3.根据权利要求2所述的靶向wnt信号通路溶瘤腺病毒的构建方法,其特征在于,所述步骤1)中需要对pshuttle-TCF/LEF-E1A(Δ24)进行鉴定,所述pshuttle-TCF/LEF-E1A(Δ24)鉴定的PCR程序为:94℃预变性10min,98℃变性45s,60℃退火1min,68℃延伸1min,30~35个循环,68℃终延伸10min。
4.根据权利要求1所述的靶向wnt信号通路溶瘤腺病毒的构建方法,其特征在于,所述步骤2)中从质粒pcDNA3-hygro上获得TSLC1基因需要进行PCR扩增,所述PCR扩增体系为:pcDNA3-hygro 1μl、TSLC1 sence引物2μl、TSLC1 antisence引物2μl、10×Buffer 5μl、MgSO4 4μl、dNTP 1μl、KOD酶1μl和ddH2O 35μl。
5.根据权利要求4所述的靶向wnt信号通路溶瘤腺病毒的构建方法,其特征在于,所述PCR扩增的程序为:94℃预变性10min,94℃预变性1min,55℃退火1min,68℃延伸1min,30~
35个循环,4℃保存。
6.根据权利要求1所述的靶向wnt信号通路溶瘤腺病毒的构建方法,其特征在于,所述步骤2)中TSLC1基因与pMD18-T-Vector连接的反应体系为:pMD18-T-Vector 1μl、TSLC1基因1μl、Ligation Mix 5μl和ddH2O 3μl。
7.根据权利要求1或6所述的靶向wnt信号通路溶瘤腺病毒的构建方法,其特征在于,所述步骤2)中的TSLC1连接产物与DH5α感受态细胞的体积比为(5~15):(190~210)。
8.根据权利要求1所述的靶向wnt信号通路溶瘤腺病毒的构建方法,其特征在于,所述步骤2)中的重组质粒经Kpn Ⅰ酶切的反应体系为:pshuttle-TCF/LEF-E1A(Δ24)8μl、Kpn Ⅰ 1μl、10×Tango Buffer 2μl和ddH2O 9μl。
9.根据权利要求1所述的靶向wnt信号通路溶瘤腺病毒的构建方法,其特征在于,所述步骤3)中线性化处理的pshuttle-TCF/LEF-E1A(Δ24)与TSLC1片段进行酶连接的体系为:线性化处理的pshuttle-TCF/LEF-E1A(Δ24)2.5μl、TSLC1片段7.5μl和Ligation high 2.0ver
10μl。