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专利号: 2016111670294
申请人: 青岛科技大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 测量;测试
更新日期:2024-02-23
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种检测力竭运动小鼠心肌连接蛋白43含量的方法,其特征在于利用抗体修饰钴纳米粒子,并利用戊二醛法将抗体修饰在氨基化磁珠表面;检测时,将含有心肌连接蛋白43的样品加入到抗体修饰的磁珠溶液中,然后加入抗体修饰钴纳米粒子,形成三明治夹心结构,随后进行分离,然后根据钴纳米粒子催化鲁米诺产生化学发光,根据化学发光强弱实现对心肌连接蛋白43含量的测定;并对力竭运动后小鼠心肌中心肌连接蛋白43含量进行测定;

测定步骤如下:

(1)钴纳米粒子的制备

首先,将制备钴纳米粒子实验所用的玻璃仪器用王水泡洗2h,烘干备用;然后在10mL浓度为1%的氯化钴CoCl2·6(H2O)中加入1.0mL浓度为10%的氢氧化钠,50℃条件下,搅拌反应30分钟,室温下冷却,得钴纳米粒子溶液,4℃条件下保存备用;

(2)抗体修饰钴纳米粒子的制备

首先,将上述所得的500μL钴纳米粒子溶液与2mL pH 7.4的磷酸缓冲溶液混合,并加入

1mM的巯基乙胺100μL,37℃条件下反应过夜,然后加入200μL含5%戊二醛的pH 7.0的0.1M磷酸缓冲溶液,在37℃下反应2小时后,用磷酸缓冲溶液离心清洗3次,再分散在磷酸缓冲溶液中,随后加入0.5mL心肌连接蛋白43抗体溶液,37℃条件下,震荡反应24h,得抗体/钴纳米粒子复合物,离心清洗后,再次分散在磷酸缓冲溶液中,4℃下保存;

(3)抗体修饰磁珠的制备

将1.0mL的氨基化磁珠溶液用2.0mL的pH 7.0的0.1M磷酸缓冲溶液洗涤3次,然后将其加入到200μL 5%戊二醛的pH 7.0 0.1M磷酸缓冲溶液中,在37℃下反应2小时后,用磷酸缓冲溶液离心清洗3次,再分散在磷酸缓冲溶液中,随后加入抗体2μg,4℃振动孵育12h,得抗体修饰磁珠;将所得复合物离心清洗后,再次分散在磷酸缓冲溶液中,4℃下保存;

(4)心肌连接蛋白43的检测

取20μL含心肌连接蛋白43的样品溶液加入到将50μL抗体修饰磁珠溶液中,37℃条件下,反应30min,然后再加入50μL抗体修饰钴纳米粒子,37℃条件下,反应2h,磁性分离清洗后,将磁性产物分散在磷酸缓冲溶液中,得磁性产物分散液,利用化学发光仪器进行化学发光测定;

(5)化学发光测定

取200μL鲁米诺溶液置于微反应器中,加入20μL过氧化氢,然后注入上述(4)所得的磁性产物分散液20μL,记录化学发光信号,根据化学发光信号的强度实现对心肌连接蛋白43含量的测定。

2.根据权利要求1所述的一种检测力竭运动小鼠心肌连接蛋白43含量的方法,其特征在于所述的心肌连接蛋白43、心肌连接蛋白43抗体购于abcam公司;

所述的氯化钴CoCl2·6(H2O)购自国药集团化学试剂有限公司;

所述的鲁米诺购自日本生化株式会社;

所述的化学发光仪器为BPCL超微弱化学发光与生物发光测量仪,购自北京纽比特科技有限公司;

离心所使用的仪器为Z446K高速离心机,购自德国的Hermle公司。