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专利号: 2016112022231
申请人: 湖南师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种仔猪肠上皮细胞分级分离方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:(1) 向60-90cm仔猪小肠肠段的肠腔中灌注37℃预热充氧的磷酸缓冲液100-150mL,用止血钳夹住肠段两端后将肠段于37℃水浴振荡器中孵育25—35分钟,孵育时的震荡速度为

65—75转/分钟;

(2) 除去肠腔中的磷酸盐缓冲液,向肠腔中灌注细胞分离液100-150mL后将肠段于37℃水浴振荡器中孵育2—3小时,孵育时的震荡速度为65—75转/分钟,根据肠段部位在孵育的不同时间点收集细胞分离液并向肠腔中灌注新的细胞分离液;

(3) 将收集的细胞分离液于4℃离心,所得沉淀即为肠上皮细胞;

所述根据肠段部位在不同时间点收集细胞分离液是:肠段绒毛顶端分化成熟上皮细胞在孵育10-40分钟时收集细胞分离液、绒毛中部正在分化上皮细胞在孵育41-90分钟时收集细胞分离液、隐窝增殖上皮细胞在孵育91-150分钟时收集细胞分离液;绒毛上部上皮细胞在孵育20分钟和40分钟时收集细胞分离液;绒毛中部上皮细胞在孵育65分钟和90分钟时收集细胞分离液;隐窝上皮细胞在孵育120分钟和150分钟收集细胞分离液;

所述磷酸盐缓冲液中各组分及浓度如下:氯化钠135-150mM、磷酸二氢钠4-6mM, 磷酸氢二钠4-6mM,苯甲基磺酰氟0.1-0.3mM,二硫苏糖醇0.4-0.6mM;

所述细胞分离液中各组分及浓度如下:氯化钠115-125mM、氯化钾4.6-5.0mM、硫酸镁

1.0-1.5mM、磷酸二氢钾1.0-1.5mM、碳酸氢钠20-30mM、4-羟乙基哌嗪乙磺酸8-12mM、D-葡萄糖1-4mM、谷氨酰胺1.0-5.0mM、谷氨酸0.5-2.5mM、乙二胺四乙酸二钠3.5-6.5mM、二硫苏糖醇0.4-0.6mM,牛血清白蛋白的重量百分比浓度为0.25%。

2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述仔猪为70日龄以下的乳仔猪。

3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述磷酸盐缓冲液和细胞分离液的pH值为

7.4。

4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(3)所述离心的条件为:4℃、400g离心

10—15分钟。

5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)所述的孵育时间为30分钟,孵育时的震荡速度为70转/分钟;步骤(2)所述的孵育时间为2.5小时,孵育时的震荡速度为70转/分钟。