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专利号: 2016112697769
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-12-11
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种反式-L-脯氨酸-4-羟化酶基因,其特征在于所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种权利要求1所述反式-L-脯氨酸-4-羟化酶基因编码的反式-L-脯氨酸-4-羟化酶,其特征在于所述酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

3.一种含权利要求1所述反式-L-脯氨酸-4-羟化酶基因的重组载体。

4.一种由权利要求3所述重组载体构建的重组基因工程菌。

5.一种权利要求1所述反式-L-脯氨酸-4-羟化酶基因在制备反式-4-羟基-L-脯氨酸酶中的应用,其特征在于所述的应用为:构建含有所述反式-L-脯氨酸-4-羟化酶基因的重组载体,将所述重组载体转化到大肠杆菌感受态细胞中,获得的重组基因工程菌进行诱导培养,取培养液分离得到含有反式-L-脯氨酸-4-羟化酶基因的菌体细胞。

6.一种权利要求2所述反式-L-脯氨酸-4-羟化酶在催化L-脯氨酸制备反式-4-羟基-L-脯氨酸中的应用,其特征在于所述的应用为:以含有反式-L-脯氨酸-4-羟化酶基因的重组工程菌经诱导培养获得的湿菌体为酶源,以L-脯氨酸为底物,以FeSO4和α-酮戊二酸为辅底物、以L-抗坏血酸为抗氧化剂、以pH5.0-7.0、60-240mM的MES缓冲液为反应介质构成反应体系,在20~40℃、150rpm条件下反应,反应完全后,将反应液分离纯化,得到产物反式-4-羟基-L-脯氨酸。

7.如权利要求6所述的应用,其特征在于所述反应体系中,湿菌体的质量用量为20g/L,底物初始浓度为0.5-2.0g/L,FeSO4终浓度为0.1-2.0mM,α-酮戊二酸终浓度为2.0-12.0mM,L-抗坏血酸终浓度为2.0-10.0mM。

8.如权利要求6所述的应用,其特征在于所述反应体系中添加有表面活性剂Nymeen-S215;所述表面活性剂Nymeen-S215的体积用量以反应体系体积计为0.5-1.5%。

9.如权利要求8所述的应用,其特征在于所述反应体系中还添加有葡萄糖,所述葡萄糖终浓度以反应体系体积计为2-10g/L。

10.如权利要求6所述的应用,其特征在于所述酶源制备步骤如下:将含有反式-L-脯氨酸-4-羟化酶基因的重组工程菌接种到含终浓度40μg/mL卡那霉素的LB液体培养基种,37℃、150rpm培养至OD600=0.8-1.0,获得种子液;将种子液以体积浓度2%的接种量转入含终浓度40μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,于37℃、150rpm条件下培养OD600=0.4-0.8,向培养液中添加终浓度0.5mM的IPTG,28℃、150rpm诱导培养10h,获得诱导培养液,将诱导培养液离心,pH 6.5、80mM的MES缓冲液洗两次后收集湿菌体,即为酶源;所述LB液体培养基组成:酵母粉5g/L,胰蛋白胨10g/L,NaCl10g/L,溶剂为水,pH值为7.0。