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专利号: 2017100242771
申请人: 临沂大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种非疾病诊断目的的探针检测miRNA或具有核酸适配体的其他靶标分子的方法,其特征在于,所述探针包括:金纳米粒子-H1复合物、金纳米粒子-H2复合物和目标物识别复合物;

其中,所述金纳米粒子-H1复合物和金纳米粒子-H2复合物分别由颈环DNA H1和H2与金纳米粒子结合而形成;

所述目标物识别复合物为用于识别miRNA的羧基磁性微球-DNA1/2复合物或用于识别靶标分子的DNA3;其中,DNA1和DNA2部分互补;

所述颈环DNA H1的序列如SEQ ID NO.1所示,H2的序列如SEQ ID NO.2所示;

其中,所述羧基磁性微球-DNA1/2复合物的制备方法为:将羧基修饰的磁珠进行活化处理,向活化后的磁珠中加入DNA1,反应3-5h,对所得复合物进行磁性分离,即得羧基磁性微球-DNA1复合物;再加入DNA2,反应1-3h,再进行磁性分离,即得羧基磁性微球-DNA1/2复合物;

所述活化处理的步骤为:将羧基修饰的磁珠中加入N-羟基琥珀酰亚胺钠盐和1M1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐,在室温下反应后将混合物进行磁性分离,并用去离子水清洗;

所述金纳米粒子-H1复合物和金纳米粒子-H2复合物的制备方法为:分别将颈环DNA H1和H2与金纳米粒子在缓冲液中进行孵育,室温反应5-7h,反应过程中少量多次添加NaCl,使其浓度达致50mM;采用琼脂糖凝胶电泳进行分离,将分离的条带放入透析膜中透析,即得;

所述缓冲液为0.5×TBE缓冲液,所述0.5×TBE缓冲液的组成为89mMTris、89mM硼酸和

2mM EDTA,pH为8.0;

所述DNA3为颈环结构,其包含能够与待检测靶标分子特异性结合的核酸适配体序列;

检测步骤如下:

(1)将目标物识别复合物分别与系列浓度梯度的待检测目标物溶液混合,反应,向反应后的溶液中加入金纳米粒子-H1复合物和金纳米粒子-H2复合物,孵育3-5h,测定孵育后溶液的紫外吸收光谱,构建待检测目标物浓度与紫外吸收峰值之间的工作曲线;

(2)提取待检测样品中的目标物,采用步骤(1)的方法,测得孵育后溶液的紫外吸收光谱,代入工作曲线,即得待检测样品中目标物的浓度。

2.如权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述miRNA为miR-203或miR-21;所述靶标分子为ATP、凝血酶、溶菌酶或表皮生长因子受体。

3.如权利要求2所述的检测方法,其特征在于,miRNA为miR-203时,所述探针中,DNA1的序列如SEQ ID NO.3所示,DNA2的序列如SEQ ID NO.4所示。

4.如权利要求2所述的检测方法,其特征在于,miRNA为miR-21时,所述探针中,DNA1的序列如SEQ ID NO.5所示,DNA2的序列如SEQ ID NO.6所示。

5.如权利要求2所述的检测方法,其特征在于,靶标分子为ATP时,DNA3的序列如SEQ ID NO.7所示。

6.如权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述金纳米粒子的制备方法为:在氯金酸和柠檬酸三钠混合液中加入冰的硼氢化钠,搅拌至溶液变成粉红色,反应2-5h,即得。

7.如权利要求6所述的检测方法,其特征在于,氯金酸和柠檬酸三钠混合液中,氯金酸的浓度为0.25mM,柠檬酸三钠的浓度为0.25mM,冰的硼氢化钠的浓度为0.1M。