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专利号: 2017100448295
申请人: 安徽师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 测量;测试
更新日期:2023-12-08
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种氧化葡聚糖包被的四氧化三铁磁性纳米材料的定量检测方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:a、制备氧化葡聚糖包被的四氧化三铁(Fe3O4@O-dextran)包被抗原和免疫原;

b、制备Fe3O4@O-dextran抗体;

c、将Fe3O4@O-dextran包被抗原经包被液稀释后包被于酶标板中,封闭、加入不同浓度的Fe3O4@O-dextran标准液,以Fe3O4@O-dextran抗体作为一抗,HRP标记的羊抗兔抗体作为二抗,进行间接竞争酶联免疫分析法;

d、以Fe3O4@O-dextran标准液浓度的对数为横坐标,吸光度值为纵坐标建立标准曲线,从而定量检测出Fe3O4@O-dextran的浓度。

2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述标准曲线的线性方程为A=1.17651-

0.07137lgC,其中A为490nm处吸光度值,C为Fe3O4@O-dextran浓度。

3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤a具体包括以下步骤:a-1、向Fe3O4@O-dextran的PBS溶液中,加入羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和牛血清白蛋白,25℃温育2-4小时后,将得到溶液装入到透析袋中透析

12h,即得到Fe3O4@O-dextran免疫原;

a-2、向Fe3O4@O-dextran的PBS溶液中,加入羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和鸡卵清白蛋白,25℃温育2-4小时后,将得到溶液装入到透析袋中透析

12h,即得到Fe3O4@O-dextran包被抗原。

4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述步骤a具体包括以下步骤:a-1、Fe3O4@O-dextran 50μL溶于4mL PBS溶液中或100μL溶于3mL PBS溶液中,然后加入

0.1mL浓度为1~10mg/mL的羟基琥珀酰亚胺溶液和0.2mL浓度为1~10mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺溶液,震荡15~30min,加入0.2mL 1%牛血清白蛋白溶液,25℃反应2~4h,将所得溶液装入透析袋中,用蒸馏水4℃透析12h收集,即得到Fe3O4@O-dextran免疫原;

a-2、Fe3O4@O-dextran 50μL溶于4mL PBS溶液中或100μL溶于3mL PBS溶液中,然后加入

0.1mL浓度为1~10mg/mL的羟基琥珀酰亚胺溶液和0.2mL浓度为1~10mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺溶液,震荡15~30min,加入0.2mL 1%鸡卵清白蛋白溶液,25℃反应2~4h,将所得溶液装入透析袋中,用蒸馏水4℃透析12h收集,即得到Fe3O4@O-dextran包被抗原;

所述Fe3O4@O-dextran中含有的Fe3O4量为80mM;

所述羟基琥珀酰亚胺溶液、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺溶液、牛血清白蛋白溶液、鸡卵清白蛋白溶液均为相应的PBS溶液。

5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤b具体包括以下步骤:b-1、首次免疫:将Fe3O4@O-dextran免疫原与福氏完全佐剂等体积比混合后,背部皮下多点注射到动物体内,注射8~10个点,注射量为1~2mL/只;首次免疫三周后进行加强免疫;

b-2、加强免疫:将Fe3O4@O-dextran免疫原与福氏不完全佐剂等体积比混合后,采取同样的方式注射到动物体内,注射量为1mL/只;此后每隔两周再进行一次加强免疫,期间采血测效价,直到抗体效价达到1:64000,进行最后一次加强免疫,从动物颈动脉采血,取血清部分制得Fe3O4@O-dextran抗体。

6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤c具体包括以下步骤:c-1、包被:用包被缓冲液将Fe3O4@O-dextran包被抗原溶液稀释200倍加入96孔酶标板中,100μL/孔,4℃过夜;

c-2、封闭:PBST溶液洗涤96孔酶标板3次,每次3min,然后加入1wt%酪蛋白封闭,每孔

200μL,37℃温育1~2h;

c-3、加样竞争:PBST溶液洗涤96孔酶标板3次,每次3min,然后将50μL不同浓度的Fe3O4@O-dextran标准液和50μLFe3O4@O-dextran抗体分梯度加入各孔中,37℃温育1.5~2h;

c-4、加酶:PBST溶液洗涤96孔酶标板3次,每次3~5min,然后每孔加入100μLPBS稀释的稀释比为1/5000的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体,37℃温育2~4h;

c-5:显色:PBST溶液洗涤96孔酶标板3次,每次3~5min,然后每孔加入100μL邻苯二胺底物液进行显色反应,37℃显色30min;

c-6、终止:每孔加入50μL 2mol/L的H2SO4终止反应,在酶标仪上测定各孔在490nm处的吸光值。