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专利号: 2017100712851
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-12-11
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种来源于嗜热踝节菌的脂肪酶突变体,其特征在于所述突变体为下列之一:1)将SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第207位脯氨酸突变为苯丙氨酸和第259位亮氨酸突变为苯丙氨酸;2)将SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第206位亮氨酸突变为苯丙氨酸、第207位脯氨酸突变为苯丙氨酸和第259位亮氨酸突变为苯丙氨酸。

2.一种权利要求1所述来源于嗜热踝节菌的脂肪酶突变体编码基因。

3.如权利要求2所述编码基因,其特征在于所述编码基因的核苷酸序列为SEQ IDNo.8或SEQ IDNo.10之一所示。

4.一种含权利要求2所述来源于嗜热踝节菌的脂肪酶突变体编码基因的重组基因工程菌。

5.一种权利要求1所述来源于嗜热踝节菌的脂肪酶突变体在水解外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯合成(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的应用,其特征在于所述的应用为:将含来源于嗜热踝节菌的脂肪酶突变体编码基因的重组基因工程菌进行发酵培养,取发酵培养液离心后的上清提取纯酶,以所述的纯酶为催化剂,以2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯为底物,添加醋酸锌,以纯水为反应介质构成反应体系,于35℃、200 rpm反应,反应过程维持pH为7.0,反应结束后,将反应液分离纯化,获得(3S)-2-羧乙基-3-氰基-

5-甲基己酸;所述反应体系中,底物终浓度为3 M,醋酸锌终浓度50 mM,纯酶添加量为300 U/mL。

6.如权利要求5所述的应用,其特征在于所述催化剂按如下方法制备:将含来源于嗜热踝节菌的脂肪酶突变体编码基因的重组基因工程菌接种至YPD培养基中,30℃培养16-22 h,获得种子液;然后将种子液以体积浓度1%接种量转接至BMGY培养基中,30℃培养16-22 h后,5000 rpm离心去上清,取沉淀用BMMY培养基重悬后,每隔12 h添加体积浓度1%甲醇,30℃诱导培养5天后,将培养液8000 rpm离心5 min;取上清,在冰浴条件下利用硫酸铵盐析法沉淀目的蛋白,沉淀过夜后,8000 rpm离心10 min,将沉淀用50 mM、pH 8.0的Tris-HCl缓冲液重悬后,透析于50 mM、pH 8.0的Tris-HCl缓冲液过夜;取截留液上样于50 mM、pH 8.0的Tris-HCl缓冲液平衡的 DEAE-Sepharose FF柱,用含0-0.5 M NaCl的50 mM、pH 8.0的Tris-HCl缓冲液线性洗脱,收集0.2 0.3 M NaCl浓度下洗脱的目的蛋白,透析于50 mM、pH ~

8.0的Tris-HCl缓冲液过夜,取截留液即为纯酶;所述YPD培养基组成为:蛋白胨20 g/L,酵母粉10 g/L,葡萄糖20 g/L,溶剂为去离子水,pH 7.0;所述BMGY培养基组成:酵母粉10 g/L,蛋白胨20 g/L,YNB 13.4 g/L,甘油10 g/L,0.1 mol/L、pH 6.0磷酸缓冲液,115℃灭菌后加入4×10-5 % 生物素;所述BMMY培养基组成为:酵母粉10 g/L,蛋白胨20 g/L,YNB 13.4 g/L,0.1 mol/L、pH 6.0磷酸缓冲液,115℃灭菌后加入4×10-5 % 生物素。