1.一种鹿中结核分枝杆菌NASBA-ELISA快速检测试剂盒，其特征是，它包括如下体系：

1)NASBA扩增反应体系，具体包括以下组分：

(a)TB基因的一对特异性引物

IS6110-F:5’-TGATGCAAGGTCGATATGAGAACGGAAAGGTCT CTTCGG-3’，其中TGATGCAAGGTCGATATGAG与检测探针一致，IS6110-R:5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGTCATCCCACACCGCTAAAGC-3’，其中AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAG为T7启动子序列，(b)NASBA扩增缓冲液：Tris-HCl为40mmol/L,pH8.5，NTP为10mmol/L，dNTP为1mmol/L，MgC12为10mmol/L，KCl为120mmol/L，DTT为5mmol/L，DMSO为100g/L；

(c)NASBA扩增酶复合液：T7 RNA聚合酶80U，SupeScript II反转录酶40U，核糖核酸酶H 

0.2U，20U RNA酶抑制剂；

2)NASBA扩增产物ELISA检测体系，具体包括以下组分：(a)TB基因的探针

特异性探针，即捕获探针：5’-Biotin-AGTAACACGTGGGTGATCTGC-3’，检测探针：5’-TGATGCAAGGTCGCATATGAG-DIG-3’；

(b)酶标板包被液和封闭液：链霉亲和素用0.05mol/L碳酸盐缓冲液、pH8.6，稀释为

0.0l25mg/mL浓度作为酶标板包被液；酶标板封闭液是0.05mol/L碳酸盐缓冲液、pH8.6和

1％BSA混合液；

(c)杂交缓冲液：20×SSPE、pH7.4，50mmol/L Tris-HCl、pH8.5，1﹪(W/V)BSA；(d)杂交抗体：碱性磷酸酶抗地高辛抗体；

(e)NASBA扩增产物ELISA检测试剂

杂交洗液：PBS、pH7.2，0.05％Tween-20；

显色液：3mg pNPP于1mL ddH2O,加入1mL二乙醇胺，-20℃避光保存；

终止液：0.5mol Na2CO3溶液。

2.一种鹿中结核分枝杆菌NASBA-ELISA快速检测方法，其特征是，它包含下述步骤：(1)设计并人工合成引起鹿结核病的常见两种病原体的多重检测引物和探针，检测时扩增混合物中的序列将分别被特异性的捕获探识别并固定于不同检测孔中，通过酶标法进行检测，人工合成的引物和探针如下：(a)TB基因的一对特异性引物

IS6110-F:5’-TGATGCAAGGTCGATATGAGAACGGAAAGGTCTCTTCGG-3’,其中TGATGCAAGGTCGATATGAG与检测探针一致，IS6110-R:5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGTCATCCCACACCGCTAAAGC-3’，其中AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAG为T7启动子序列，特异性探针，即捕获探针：5’-Biotin-AGTAACACGTGGGTGATCTGC-3’，检测探针：5’-TGATGCAAGGTCGCATATGAG-DIG-3’；

(2)NASBA扩增模板牛型结核分枝杆菌RNA的制备将牛结核分枝杆菌菌株ATCC27289(BCG)，购自北京中原经贸公司ATCC菌种保存中心中国代理，转移至研磨管中,加入少许生理盐水，用磨棒磨成悬液后转移至改良罗氏培养基上，37℃培养3～5周；

5ml离心管中选取部分菌落悬浮于PBS、pH 7.4溶液中，使每毫升溶液细胞浓度达到1×

109，然后分别取1ml培养液于1.5ml离心管中80灭活20min，12000r/min离心2min,弃上清液；

加入冰冷的1：3比例的甲醇氯仿混悬液500μL，涡旋振荡60S，立刻加入Trizol试剂2mL，再涡旋振荡10s，冰浴10min；

4℃，120000r/min，离心15min，轻取上层水相，加入等量的冰冷异丙醇轻轻混匀，－20℃静置1h；

4℃，10000r/min，离心10min，弃上清；

70％乙醇洗两次，6000r/min，离心3min，弃清液，自然干燥；

加50μL DEPC处理的TE溶液溶解；

(3)NASBA扩增反应体系及程序：

(a)NASBA扩增反应液制备：10μL扩增反应液包含1mmol/L dNTP，10mmol/L NTP，

40mmol/L Tris-HC1、pH8.5，10mmol/L MgC12，120mmol/L KCl，5mmol/L DTT，100g/L DMSO，上、下游引物各0.2μmol/L；

(b)酶反应液制备：5μL酶反应液包含40U SupeScript II反转录酶，80U T7RNA聚合酶，

0.2U核糖核酸酶H和20U RNA酶抑制剂；

(c)扩增反应体系及程序采用20μL体系：反应管中加入10μL扩增反应液，再加入0.5μL结核分枝杆菌总RNA，65℃加热2min以去除RNA的二级结构，41℃冷却2min,同时以无菌水做阴性对照；

立即加入5μL酶反应液，轻弹混匀，41℃反应90min，冰浴2min终止反应，置于-20℃贮存备用；

(4)酶标板的制备：

(a)酶标板包被液制备：链霉亲和素用0.05mol/L碳酸盐缓冲液、pH8.6，稀释为

0.0l25mg/mL浓度；

(b)酶标板封闭液制备：0.05mol/L碳酸盐缓冲液、pH8.6和1％BSA混合液；

(c)酶标板制备：96孔酶标板上每孔加入100μL链霉亲和素酶标板包被液室温过夜包被酶标板；每孔加入100μL酶标板封闭液对酶标板进行封闭，37℃恒温2h，用PBST洗板35次，4℃避光保存备用；

(5)NASBA扩增产物ELISA检测：

(a)杂交反应：每孔中各加入43μL杂交缓冲液、2μL探针混合液和5μL NASBA扩增产物，轻轻振荡混匀，41℃反应30min，并用TBST洗板3～5次，每孔加入100μL碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体1：5000稀释，室温反应至少30min，TBST洗板3～5次；

(d)显色反应：每孔加入100μL pNPP进行显色，室温避光显色10min，立即加入100μL碳酸钠终止显色反应，酶标仪测定OD405数值，OD≥0.27为阳性，OD<0.27为阴性。