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专利号: 2017103250500
申请人: 山东师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-07-12
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种基于依赖解旋酶DNA恒温扩增技术检测microRNA的方法,其特征在于,步骤如下:(1)提取样品中的总RNA;

(2)向提取的总RNA中加入单链DNA探针和过量的核酸外切酶I,在反应缓冲液中进行孵育,实现目标microRNA与单链DNA探针的特异性结合,利用过量的核酸外切酶I将多余的单链DNA探针消除;

(3)向步骤(2)的反应体系中加入上游引物、下游引物、单链结合蛋白和解旋酶,对目标microRNA进行扩增反应,通过荧光信号检测目标microRNA的表达。

2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)中,提取样品中的总RNA采用的方法为:利用总RNA提取试剂盒对样品中的RNA进行抽提与纯化。

3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)中,所述反应缓冲液中含有:1毫摩尔每升的二硫苏糖醇、1×核酸外切酶I反应缓冲液、20个单位的RNA酶抑制剂、10毫摩尔每升的氯化钠以及10毫摩尔每升的pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。

4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)中,孵育的温度为95℃,孵育的时间为5min。

5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(3)中,扩增反应的温度为60-70℃,扩增反应的时间为30min。

6.一种检测microRNA的试剂和/或试剂盒,其特征在于,包括:单链DNA探针、上游引物和下游引物。

7.根据权利要求6所述的试剂和/或试剂盒,其特征在于,所述单链DNA探针中包含HDA扩增的模板序列,并且所述单链DNA探针的3’末端与待检测的目标microRNA完全互补;

所述上游引物与单链DNA探针的3’端互补;所述下游引物与单链DNA探针的5’端一致。

8.根据权利要求6所述的试剂和/或试剂盒,其特征在于,所述试剂和/或试剂盒中还包括:核酸外切酶I、单链结合蛋白和解旋酶。

9.一种检测miR-21的试剂和/或试剂盒,包括:单链DNA探针、上游引物、下游引物、核酸外切酶I、单链结合蛋白和解旋酶;

所述单链DNA探针的序列如SEQ ID NO.1所示;所述上游引物和下游引物的序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

10.权利要求6-8任一项所述的试剂和/或试剂盒在非疾病的诊断目的的检测microRNA中的用途。