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专利号: 2017103255699
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-12-11
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种腈水解酶突变体,其特征在于所述突变体是将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第201位,第339位和第343位氨基酸中的一位或多位进行突变获得的。

2.如权利要求1所述腈水解酶突变体,其特征在于所述突变体为下列之一:(1)将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第201位苏氨酸突变为苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或色氨酸;

(2)将SEQ ID No.2所示氨基酸序列第339位谷氨酰胺突变为赖氨酸;(3)将SEQ ID No.2所示氨基酸序列第343位谷氨酸突变为赖氨酸;(4)将SEQ ID No.2所示氨基酸序列第201位的苏氨酸突变为苯丙氨酸,同时将第339位和第343位谷氨酸突变为赖氨酸。

3.一种权利要求1所述腈水解酶突变体的编码基因。

4.一种由权利要求3所述编码基因构建的重组载体。

5.一种由权利要求4所述重组载体转化获得的重组基因工程菌。

6.一种权利要求1所述腈水解酶突变体在催化双腈化合物制备单氰基羧酸化合物中的应用。

7.如权利要求6所述的应用,其特征在于所述的应用以含腈水解酶突变体编码基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体、湿菌体固定化细胞或者湿菌体超声破碎后提取的纯酶为催化剂,以双腈化合物为底物,以pH=7.0、200M磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液为反应介质构成反应体系,45℃恒温水浴反应,反应完全后,将反应液分离纯化,获得单氰基羧酸化合物;

所述双腈化合物为1-氰基环己基乙腈、丙二腈或丁二腈。

8.如权利要求7所述的应用,其特征在于所述反应体系中,底物终浓度以缓冲液体积计为100~1000mM,所述催化剂用量以湿菌体重量计为10~100g/L缓冲液。

9.如权利要求7所述的应用,其特征在于所述催化剂按如下方法之一制备:(1)将含腈水解酶突变体编码基因工程菌接种到LB培养基中,37℃培养10-12小时,按体积浓度2%的接种量接种至含终浓度50mg/L卡那霉素的LB培养基进行扩大培养,37℃培养至培养液的OD600为0.6-0.8之间,加入终浓度为0.1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷,28℃诱导培养10小时,离心,收集菌体,用生理盐水清洗2次,得到湿菌体;(2)将步骤(1)湿菌体用含终浓度

300mM NaCl的pH 8.0、50mM NaH2PO4缓冲液重悬,超声波破,破碎产物离心后取上清液作为粗酶液;将粗酶液以1mL/min的流速通过经平衡缓冲液冲洗的Ni-NTA柱,用洗脱缓冲液洗脱弱吸附的杂蛋白,流速为2mL/min;再用蛋白洗脱缓冲液洗脱并收集目的蛋白,流速为2mL/min;最后将收集的目的蛋白以质量浓度0.9%氯化钠水溶液为透析液进行透析,取截留液即为纯酶;所述平衡缓冲液为含终浓度300mM NaCl的pH 8.0、50mM NaH2PO4缓冲液;所述洗脱缓冲液为含终浓度300mM NaCl和50mM咪唑的pH 8.0、50mM NaH2PO4缓冲液;所述蛋白洗脱缓冲液为含终浓度300mM NaCl和250mM咪唑的pH 8.0、50mM NaH2PO4缓冲液;(3)将步骤(1)湿菌体悬浮于pH=7.0、200mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液体系中,加入6mg/mL硅藻土,室温搅拌1h,随后加入体积终浓度3%聚乙烯亚胺,室温搅拌1h,最后加入体积终浓度1%戊二醛,搅拌1h,真空抽滤,获得固定化细胞;所述聚乙烯亚胺以质量浓度5%水溶液形式加入,所述戊二醛以质量浓度25%水溶液形式加入。