1.一种测定肝微粒体中芍药苷代谢产物的方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)肝微粒体中芍药苷代谢产物的获得:在培养瓶中,于Tris-HCl缓冲溶液中,加入肝微粒体、NADP、NADH、G-6-P、G-6-P DH和MgCl2,混合均匀,在37℃全温振荡器中温孵5min后,加入芍药苷的Tris-HCl缓冲溶液,得温孵体系;温孵1-3h,温孵过程中,每20min在液面上通O2半分钟,反应后,将培养瓶从振荡器中取出,迅速加入甲醇终止代谢反应,得芍药苷代谢产物;
2)样品处理:将芍药苷代谢产物涡旋振荡30s,转速5000r/min下离心10min,吸取上清液,旋转蒸干,加入甲醇振荡复溶,再次离心,吸取上清液,在氮气下吹干后,残留物用甲醇复溶,过0.22μm微孔滤膜,进高效液相色谱检测;
3)样品测定:芍药苷代谢产物的检测,具体条件如下:色谱条件:色谱柱:DiamonsilTMODS C18流速:0.2mL/min
柱温:30℃
进样量:1μL
检测波长:230nm
流动相:A:水+1%的甲酸,B:乙腈+1%的甲酸,采用梯度洗脱,程序如表1表1时间(min) A(%) B(%)
0 90 10
2 70 30
4 40 60
8 5 95
10 5 95
11 90 10
15 90 10
质谱条件:
一级质谱:电离模式:电喷雾电离(ESI)扫描模式:负离子扫描
毛细管电压:2.8kV
锥孔电压:3.0V
源温度:110℃
脱溶剂温度:300℃
脱溶剂气体流量:500L/Hr
二级质谱:电离模式:电喷雾电离(ESI)扫描模式:负离子扫描
碰撞气:氮气
毛细管电压:2.8kV
锥孔电压:3.0V
源温度:110℃
脱溶剂温度:300℃
脱溶剂气体流量:500L/Hr
碰撞能量:15-35eV。
2.根据权利要求1所述的一种测定肝微粒体中芍药苷代谢产物的方法,其特征在于:步骤1),所述的温孵体系中:肝微粒体浓度为1.0-3.0mg/L,NADP浓度为0.6-1.0mmol/L,NADH浓度为0.3-0.8mmol/L,G-6-P浓度为8.0-12.0mmol/ml,G-6-P DH浓度为0.5-1.5IU/mL,Mg2+浓度为4.0mmol/L,芍药苷浓度为0.1mg/mL。
3.根据权利要求2所述的一种测定肝微粒体中芍药苷代谢产物的方法,其特征在于:步骤1),所述的温孵体系中:肝微粒体浓度为2.0mg/L,NADP浓度为1.0mmol/L,NADH浓度为
0.5mmol/L,G-6-P浓度为10.0mmol/ml,G-6-P DH浓度为1.0IU/mL,Mg2+浓度为4.0mmol/L,芍药苷浓度为0.1mg/mL。
4.根据权利要求1所述的一种测定肝微粒体中芍药苷代谢产物的方法,其特征在于:所述肝微粒体为小鼠、大鼠、狗、兔或人的肝微粒体。
5.根据权利要求1所述的一种测定肝微粒体中芍药苷代谢产物的方法,其特征在于:Tris-HCl缓冲溶液的浓度为0.05mol/L,pH 7.4。
6.根据权利要求1所述的一种测定肝微粒体中芍药苷代谢产物的方法,其特征在于:步骤3)中,所述的色谱柱,型号为DiamonsilTMODS C18色谱100mm×2.1mm,1.8μm。