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专利号: 2017103635397
申请人: 河池学院
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-12-04
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种厚垣镰孢霉分离纯化获得β-葡萄糖苷酶的方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)固体发酵产β-葡萄糖苷酶:将筛选得到的厚垣镰孢霉HML278通过生理盐水制成孢子液,并将孢子液转入以甘蔗渣和麸皮为碳源的固体培养基中固态发酵,产含β-葡萄糖苷酶的培养物;(2)制备粗酶液:将步骤(1)制得的培养物加入200-250  mL无菌ddH2O,30℃-50℃恒温水浴1-3h浸提,四层纱布过滤,5000-7000  r/min离心5-15  min得到粗酶液,收集上清酶液2℃-6℃保存备用;(3)非变性凝胶电泳:在2℃-6℃条件下,用步骤(2)中收集到的上清酶液在分离胶质量分数为5%-10%、浓缩胶质量分数为2%-8%、恒定电压为30V-100V的条件下进行非变性凝胶电泳22h-25h,得到含β-葡萄糖苷酶的凝胶;(4)β-葡萄糖苷酶活性染色:在2℃-6℃条件下,剪切步骤(3)中含β-葡萄糖苷酶的凝胶得到凝胶胶条,对该凝胶胶条活性染色,活性染色液为质量分数为0.1%的七叶苷和质量分数为0.03%的三氯化铁,在25℃-35℃下反应3  min-10  min,凝胶胶条中含有β-葡萄糖苷酶活性的蛋白催化底物产生黄黑色产物,以该染色凝胶胶条为导向,可确定步骤(3)中电泳凝胶上含有β-葡萄糖苷酶的活性蛋白条带的位置;(5)提取:在2℃-6℃条件下,以步骤(4)中染色凝胶胶条为导向,将步骤(3)中电泳凝胶上含有β-葡萄糖苷酶的活性蛋白条带剪下,放入预冷研钵中磨碎后用pH为4.0-5.5、质量浓度为10-30mmol/L的柠檬酸-柠檬酸盐缓冲液浸提10-15h,再用5000道尔顿超滤管以3000-5000r/min的转速离心15-30min浓缩脱盐;(6)纯化:在2℃-6℃条件下,将步骤(5)中的酶液洗脱分离蛋白质,洗脱分离蛋白质的工艺条件是以pH为7.2-7.5的0.05-0.10mol/l的PBS缓冲液添加0.15-0.20mol/L的NaCl溶液为洗脱缓冲液、洗脱压力为73-75psi、洗脱缓冲液流速为1-3mL/min,得到精制β-葡萄糖苷酶。2.根据权利要求1所述的一种厚垣镰孢霉分离纯化获得β-葡萄糖苷酶的方法,其特征在于,所述步骤(1)中固体发酵时间为3-5天,固体发酵温度为25℃-40℃。3.根据权利要求1所述的一种厚垣镰孢霉分离纯化获得β-葡萄糖苷酶的方法,其特征在于,所述步骤(3)中上清酶液在分离胶质量分数为8%、浓缩胶质量分数为4%、恒定电压为50V的条件下进行非变性凝胶电泳23h,得到含β-葡萄糖苷酶的凝胶。4.根据权利要求1所述的一种厚垣镰孢霉分离纯化获得β-葡萄糖苷酶的方法,其特征在于,所述步骤(4)中凝胶胶条活性染色是在30℃下反应5min。5.根据权利要求1所述的一种厚垣镰孢霉分离纯化获得β-葡萄糖苷酶的方法,其特征在于,所述步骤(5)将活性蛋白条带剪下,放入预冷研钵中磨碎后用pH为4 .8、质量浓度为20mmol/L的柠檬酸-柠檬酸盐缓冲液浸提12h,再用5000道尔顿超滤管以4000r/min的转速离心20min浓缩脱盐。6.根据权利要求1所述的一种厚垣镰孢霉分离纯化获得β-葡萄糖苷酶的方法,其特征在于,所述步骤(6)中洗脱缓冲液流速为2mL/min。7.如权利要求1~6任一条所述的厚垣镰孢霉分离纯化获得β-葡萄糖苷酶在生物乙醇、造纸方面的应用。8.如权利要求1~6任一条所述的厚垣镰孢霉分离纯化获得β-葡萄糖苷酶在将纤维二糖

水解得到葡萄糖方面的应用。9.如权利要求1~6任一条所述的厚垣镰孢霉分离纯化获得β-葡萄糖苷酶利用低分子量单糖合成纤维三糖和纤维四糖方面的应用。