1.一种龙胆苦苷人工抗原,其特征在于:该人工抗原包括含有羧基的龙胆苦苷半抗原分子以及通过所述羧基与该半抗原分子偶联的载体蛋白,所述载体蛋白选自牛血清白蛋白BSA或鸡卵清蛋白OVA,所述半抗原分子的结构如式I所示:
2.一种龙胆苦苷人工抗原的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:
1)采用琥珀酸酐法对龙胆苦苷进行结构修饰
将55~60mg龙胆苦苷、95~105mg琥珀酸酐及3~5mL吡啶混合后于100~115℃回流7~
13h,得反应液,将反应液以及3~5mL质量分数36~38%盐酸与18~22mL的≤4℃蒸馏水混合后用氯仿萃取,除去氯仿层后通过减压蒸馏得棕色粉末,即为龙胆苦苷半抗原,记为GTP-SA;
2)利用混合酸酐法将龙胆苦苷半抗原与载体蛋白偶联,所述载体蛋白选自牛血清白蛋白BSA或鸡卵清蛋白OVA。
3.根据权利要求2所述的龙胆苦苷人工抗原的制备方法,其特征在于:所述步骤2)具体包括以下步骤:
2.1)将15~25mg GTP-SA、0.4~0.6mL二甲基甲酰胺以及70~80μL三正丁胺混合后冷却至0~1℃,得混合物,向混合物中加入15~25μL氯甲酸异丁酯后于9~11℃下搅拌25~
35min,得到反应液A;
2.2)将65~75mg牛血清白蛋白BSA和65~75mg鸡卵清蛋白OVA分别加入至5~7mL二甲基甲酰胺:水的体积比为1:3~5的混合溶剂中,得到含有BSA的反应液B1和含有OVA的反应液B2;
2.3)将反应液A平均分成2份,分别加入至反应液B1和B2中于0~1℃搅拌混匀,得到混合后的反应液A-B1和A-B2,将A-B1和A-B2置于3~5℃下搅拌10~12h;然后,将A-B1和A-B2分别装入截留分子量为8000~14000的透析袋中,以磷酸盐缓冲液为透析液,在3~5℃下透析3~4天,在透析处理期间,每间隔5~7小时换一次透析液;然后,将透析处理后的A-B1进行冷冻干燥,得龙胆苦苷人工抗原GTP-BSA,将透析处理后的A-B2进行冷冻干燥,得龙胆苦苷人工抗原GTP-OVA。
4.一种龙胆苦苷间接竞争ELISA检测的建立方法,其特征在于:该建立方法包括以下步骤:
1)利用琥珀酸酐法对龙胆苦苷进行结构修饰
将55~60mg龙胆苦苷、95~105mg琥珀酸酐及3~5mL吡啶混合后于100~115℃回流7~
13h,得反应液,将反应液以及3~5mL质量分数36~38%盐酸与18~22mL的≤4℃蒸馏水混合后用氯仿萃取,除去氯仿层后通过减压蒸馏得棕色粉末,得到含有羧基的龙胆苦苷半抗原;
2)利用混合酸酐法将龙胆苦苷半抗原分别与牛血清白蛋白BSA及鸡卵清蛋白OVA偶联,制备得到相应的两种龙胆苦苷人工抗原GTP-BSA及GTP-OVA;
3)运用两种龙胆苦苷人工抗原分别对动物进行免疫,结合利用间接ELISA检测,并以相对应的另一种人工抗原为包被抗原测定动物抗血清的效价,从而确定可获得最优抗血清效价的动物免疫方案;
4)以龙胆苦苷为竞争抗原,通过测定龙胆苦苷对抗原-抗体结合反应的竞争抑制率,从而建立针对龙胆苦苷的竞争抑制曲线以及间接竞争ELISA标准曲线。
5.根据权利要求4所述一种龙胆苦苷间接竞争ELISA检测的建立方法,其特征在于:所述对动物进行免疫具体包括以下步骤:以GTP-BSA或GTP-OVA为免疫抗原,将免疫抗原用生理盐水稀释至2~4mg/mL,取1~5mL稀释后的免疫抗原与该免疫抗原体积10~15%的佐剂混匀,然后对动物通过多次肌肉多点注射完成免疫。
6.根据权利要求4所述一种龙胆苦苷间接竞争ELISA检测的建立方法,其特征在于:所述间接ELISA检测中,包被抗原的包被浓度为1:1000~1:8000,包被液为碳酸盐缓冲液,封闭液为山羊血清:PBS的体积比为1:8~12的混合液,酶标二抗的浓度为1:1000~1:10000。
7.根据权利要求4所述一种龙胆苦苷间接竞争ELISA检测的建立方法,其特征在于:所述间接竞争ELISA检测中,竞争反应时间为10~60min,龙胆苦苷溶剂为体积分数为10~
50%的甲醇水溶液。
8.根据权利要求4所述一种龙胆苦苷间接竞争ELISA检测的建立方法,其特征在于:所述建立方法还包括以下步骤:根据龙胆苦苷浓度为横坐标的间接竞争ELISA竞争抑制曲线获得检测灵敏度;根据龙胆苦苷浓度对数为横坐标的间接竞争ELISA标准曲线,获得其线性回归方程;根据龙胆苦苷的检测灵敏度与其结构相似物的检测灵敏度比值得到交叉反应率。
9.根据权利要求8所述一种龙胆苦苷间接竞争ELISA检测的建立方法,其特征在于:所述结构相似物选自獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、栀子苷、马钱苷和橄榄苦苷。
10.一种龙胆苦苷多克隆抗体的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:
1)利用琥珀酸酐法对龙胆苦苷进行结构修饰
将55~60mg龙胆苦苷、95~105mg琥珀酸酐及3~5mL吡啶混合后于100~115℃回流7~
13h,得反应液,将反应液以及3~5mL质量分数36~38%盐酸与18~22mL的≤4℃蒸馏水混合后用氯仿萃取,除去氯仿层后通过减压蒸馏得棕色粉末,得到含有羧基的龙胆苦苷半抗原;
2)利用混合酸酐法将龙胆苦苷半抗原分别与牛血清白蛋白BSA及鸡卵清蛋白OVA偶联,制备得到相应的两种龙胆苦苷人工抗原GTP-BSA及GTP-OVA;
3)运用两种龙胆苦苷人工抗原分别对动物进行免疫,得到对应的免疫血清。