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专利号: 2017104287428
申请人: 广西大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 有机化学〔2〕
更新日期:2023-12-11
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种血管紧张素转化酶抑制肽,其特征在于,其氨基酸序列为:Leu-Leu-Tyr-Gln-Glu-Pro-Val-Leu-Gly-Pro-Val-Pro-Arg。

2.一种权利要求1所述的血管紧张素转化酶抑制肽的制备提取方法,其特征在于,包括以下步骤:

S1.磁性二氧化硅微球的制备:取0.03~0.05g Fe3O4、0.95~1.05mL正硅酸乙酯(TEOS)和0.08~0.12mL聚乙二醇单辛基苯基醚(TritionX-100)加入100mL乙醇/水混合液中并以

50~60KHz功率超声分散8~15min,然后加入9mL浓度为25%的氨水,反应2~3h后利用外加磁场分离出固体产品得到磁性二氧化硅微球,所述Fe3O4的粒径为10~30nm,所述乙醇/水混合液中乙醇和水的体积比为1:1;

S2.限进亲和介质的制备:利用3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)将S1中的磁性二氧化硅微球进行氨基化改性得到氨基化微球,再用环氧氯丙烷对氨基化微球进行活化,然后用活化后的氨基化微球螯合铜离子得到螯合微球;将1~2g聚乙二醇单甲醚5000(mPEG-5000)加入装有4~8mL二甲基亚砜(DMSO)的三口瓶中,再向三口瓶中加入1.5~3mL氯仿及0.6~

0.8mL乙酸酐并在35~40℃反应12h,得到mPEG-CHO;将0.2g的螯合微球溶于50~100mL乙醇/水(乙醇和水的体积比为1:1)混合溶液中,加入1g的mPEG-CHO,在室温下搅拌反应24h后再加入0.05~0.08g还原剂NaBH3,继续反应48h,将反应后产物置于透析袋中,在蒸馏水中透析48h,最后磁性分离得到限进亲和介质;

S3.将酪蛋白用胰蛋白酶和胃蛋白酶在55℃下酶解2h以上得到酶解液,然后采用10KDa超滤离心管对酶解液进行超滤得到滤液,将10mg S2中的限进亲和介质加入2mL滤液中进行吸附1~2h,然后利用外加磁场分离出限进亲和介质,再用0.5~1mL浓度为0.5~1mol/L的氯化铵和0.5~1mL浓度为0.5~1mol/L的氯化钠对其洗脱0.5~1h得到洗脱液,旋转蒸发洗脱液得到浓缩液;

S4.采用HPLC对S3中所述浓缩液进行分离,流动相为:A相为水(1%TFA),B相为乙腈(1%TFA);分离程序为:0~40min,B相乙腈体积由5%到30%,流速为0.5mL/min,检测波长为280nm,分离收集到氨基酸序列为Leu-Leu-Tyr-Gln-Glu-Pro-Val-Leu-Gly-Pro-Val-Pro-Arg的血管紧张素转化酶抑制肽。

3.根据权利要求2所述的血管紧张素转化酶抑制肽的制备提取方法,其特征在于,S2中所述氨基化微球的制备方法为:取0.2g S1中的磁性二氧化硅微球置于三口瓶中,加入

200mL乙醇,2mL去离子水,然后超声分散30min,再以400~600r/min的转速搅拌10min,向三口瓶中逐滴加入1.8~2.2mLAPTES,在72~78℃下回流8~10h,反应结束后用磁铁在瓶底吸附,倾去上清液,再加入无水乙醇,经超声、洗涤,最后磁性分离得到氨基化微球。

4.根据权利要求2所述的血管紧张素转化酶抑制肽的制备提取方法,其特征在于,S2所述螯合微球的制备方法为:称取0.15g S2中的氨基化微球,加入2.5mL浓度为0.4mol/L的NaOH和2.5mL浓度为2.5mol/L环氧氯丙烷,接着加入0.9~1.1mL的DMSO,在30~40℃下摇床振荡4h,然后去离子水洗涤得到环氧化微球,将制备出的环氧化微球加入20mL浓度为

0.5mol/L的Na2CO3溶液中,再加入0.05~0.1g亚氨基二乙酸(IDA),在40~50℃下反应8h,反应结束后加入20mL浓度为0.05mol/L的CuSO4溶液,摇床震荡2h得到螯合微球。

5.根据权利要求2所述的血管紧张素转化酶抑制肽的制备提取方法,其特征在于,所述胰蛋白酶和胃蛋白酶的质量比为1:1,所述胰蛋白酶与酪蛋白的质量比为1:60~100。

6.根据权利要求2所述的血管紧张素转化酶抑制肽的制备提取方法,其特征在于,所述限进亲和介质的Cu2+螯合密度不低于50μmol/g,mPEG-5000的接枝率为10%~50%。

7.权利要求1中的血管紧张素转化酶抑制肽在制备减缓高血压症状的功能食品中的应用。