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专利号: 2017105014019
申请人: 湖北工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种棉铃虫甾醇载体蛋白2的保存方法,其特征在于:包括以下步骤:

(1)基因工程菌的构建:目的基因为棉铃虫甾醇载体蛋白2基因,所述棉铃虫甾醇载体蛋白2基因序列如SEQ ID No.1的碱基序列所示;载体为PET28a质粒;表达菌株为大肠杆菌BL21;利用基因工程技术得到基因工程菌PET28a-HaSCP2-BL21;

(2)目的蛋白的大量表达:培养PET28a-HaSCP2-BL21基因工程菌10~14L,菌液的菌体密度OD600达到0.5~0.6时利用IPTG诱导PET28a-HaSCP2-BL21基因工程菌胞内表达棉铃虫甾醇载体蛋白2,棉铃虫甾醇载体蛋白2蛋白的表达量达到细胞总蛋白的40%以上后离心收集菌体;

(3)目的蛋白的保存:用药匙每次挖取菌体10~20g放入液氮中,在液氮的快速冷却作用下菌体被冷冻成固态球状的菌球,待所得的菌体被液氮冷冻成若干个菌球后,将所有的菌球置于-80℃的冰箱保存;

(4)目的蛋白的使用:根据需要的蛋白量,每次从-80℃的冰箱内取出适量数量的菌球,将菌球溶解于缓冲液中,待完全溶化后依次经细胞破碎,蛋白纯化后得到目的蛋白。

2.根据权利要求1所述的棉铃虫甾醇载体蛋白2的保存方法,其特征在于:所述步骤(1)中包括三个过程:A、从棉铃虫五龄幼虫中肠中提取总RNA;B、利用RT-PCR技术扩增棉铃虫甾醇载体蛋白2基因;C、将棉铃虫甾醇载体蛋白2基因在限制性内切酶的作用下插入PET28a质粒中得到表达载体PET28a-HaSCP2,再将表达载体PET28a-HaSCP2转化到大肠杆菌BL21后通过蓝白斑筛选阳性克隆得到基因工程菌PET28a-HaSCP2-BL21。

3.根据权利要求2所述的棉铃虫甾醇载体蛋白2的保存方法,其特征在于:所述过程B中,RT-PCR技术包括反转录过程和PCR过程,首先利用反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA,然后以cDNA为PCR的模板,进行PCR过程,PCR扩增体系包括引物HaSCP2F-BamH Ⅰ和HaSCP2R-HindⅢ;HaSCP2F-BamH Ⅰ碱基序列如SEQ ID No.2所示,HaSCP2R-HindⅢ碱基序列如SEQ ID No.3所示。

4.根据权利要求1或2或3所述的棉铃虫甾醇载体蛋白2的保存方法,其特征在于:所述步骤(2)包括两个过程:A、菌体的活化过程:将步骤(1)中得到的基因工程菌PET28a-HaSCP2-BL21接种入5mL LB培养基中活化培养,当LB培养基OD600为0.5时,加入终浓度1mM IPTG进行诱导培养,利用SDS-PAGE凝胶电泳检测目的蛋白诱导表达量;B、大量诱导表达过程:当HaSCP-2蛋白表达量占到细胞总蛋白的40%以上时,将活化后的菌体接种于10~14L LB培养基中培养,当培养基OD600为0.5时,加入终浓度1mM IPTG进行大量诱导培养,棉铃虫甾醇载体蛋白2蛋白的表达量达到细胞总蛋白的40%以上后离心收集菌体。