1.一种pH荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤包括：

（1）将NBD-Cl按照浓度0.001～0.008g/mL溶解于氯仿中，然后再加入同体积氯仿的溶液，氯仿的溶液为氯仿中含有体积分数0.39～1%的水合肼-甲醇溶液，混合均匀，室温下搅拌得棕色沉淀，至沉淀完全析出，过滤，滤饼经乙酸乙酯洗涤，烘干，得NBD肼；

（2）将氯铬酸吡啶盐加入到二氯甲烷中，加入浓度0.041～0.12g/mL，超声溶解，然后加入浓度0.02～0.08 g/mL的4-（氯甲基）苯甲醛，氮气保护下室温搅拌反应3～4 h，反应完成后加入二氯甲烷3～4倍体积的无水乙醚，搅拌5min后静置分层，移除上清液，取下层胶状物，再加前述同体积的无水乙醚，研磨20min，依次用水、5wt%碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥、旋蒸，得白色晶体；

（3）将步骤（2）白色晶体溶解于无水乙醇中，溶解浓度0.002～0.006 g/mL，然后加入浓度0.002～0.004g/mL的NBD肼，再滴加无水乙醇体积1%的冰乙酸，加热回流反应3～4h，反应结束后旋蒸除去溶剂，再经硅胶柱纯化、梯度洗脱，得橘红色固体粉末，即PH荧光探针；所述梯度洗脱，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇 500 ：1至200 ：1。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述水合肼-甲醇溶液中，水合肼体积浓度为0.2～1.2%；所述NBD-Cl 按照浓度0.004g/mL溶解于氯仿中。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，氯铬酸吡啶盐加入到二氯甲烷中浓度为0.083g/mL，然后加入4-（氯甲基）苯甲基醇的浓度为0.05g/mL；所述二氯甲烷为新蒸无水二氯甲烷；采用点板跟踪反应进程，原料消耗完后即为终点；所述洗涤，依次用水洗三次、5wt%碳酸氢钠洗两次、饱和氯化钠溶液洗一次，每次洗涤液用量为无水乙醚体积的0.5倍。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，步骤（2）白色晶体于无水乙醇中溶解浓度为0.004g/mL，然后加入NBD肼的浓度为0.0032g/mL；所述硅胶柱纯化，选用二氯甲烷溶解。

5.根据权利要求1所述的的制备方法，其特征在于：制备得到的PH荧光探针效果判断指标如下：吸收波长改变：pH值从酸性到中性吸收向红光移动近100 nm；

检测范围：pH1.98～7.00范围内存在线性关系。

6.权利要求1～5任一项所述制备方法制备得到pH荧光分子探针在制备适用于生物样本中、细胞内线粒体/膜内pH检测分析、组织粘膜上pH检测分析的试剂中、制备应用于生命有机分析、分析化学、疾病预诊及医学临床检测相关领域的试剂中的应用，其特征在于，所述的生物样本包括食管粘膜、胃粘膜和Hela细胞。

7.根据权利要求6所述的应用，提供一种采用权利要求1 5任一项所述pH荧光分子探针~用于细胞内线粒体/膜内pH值的实时检测方法，其特征在于：步骤包括：

1）配制溶液

配制CM-BHNBD探针储备液：准确称取pH荧光分子探针溶于无水乙腈，配制浓度为1×10-4mol/L，得CM-BHNBD探针储备液；

配制待测目标物Britton-Robison缓冲液：用0. 04 mol/L磷酸、硼酸和醋酸配制而成，使用时用0. 2 mol/L 的 NaOH水溶液调节至所需pH值；

2）建立pH值与荧光信号强度的线性方程

取步骤1）配制的待测目标物缓冲液稀释得到梯度浓度的 pH值为2～7的缓冲标准品溶液，各取200μL分别与30μL CM-BHNBD探针储备液和770 µL待测物储备液混合后，振摇混合均匀，于37 ℃下放置5min，然后经荧光分光光度计或紫外光谱仪检测，建立pH值与荧光信号强度的线性方程；

3）建立pH的线性关系，采用a）或b）方法确定样品pH值

a）荧光检测法：将1000µL待测样品注入石英比色皿后，置入紫外分光光度计，收集最大吸收波长位置的强度，求出反应前后最大吸收峰强度比率并代入紫外的线性关系中，计算+得细胞内H浓度含量，确定pH值；

b）紫外检测法：将1000µL待测样品注入石英比色皿后，置入紫外分光光度计，收集最大吸收波长位置的强度，求出反应前后最大吸收峰强度比率并代入紫外的线性关系中，计算得细胞内H+浓度含量，确定pH值。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：步骤2）中，梯度浓度的缓冲标准品溶液pH依次为2、3、4、5、6、7。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：分别以荧光检测或紫外检测的方法对细胞内H+进行平行多次检测，并与标准品进行校准，得到荧光/紫外检测的最优检测范围，从而根据不同样品所含待测物的浓度范围来选择最优化的检测手段进行定量。