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专利号: 2017105286193
申请人: 河南科技大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 测量;测试
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种检测乙氧酰胺苯甲酯的免疫试剂盒的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:

步骤一、乙氧酰胺苯甲酯半抗原的制备

以对氨基水杨酸为原料,甲酯化后,在1w-9w的微波环境中进行乙基化反应,制备4-氨基-2-乙氧基苯甲酸甲酯;

或,以4-硝基-2-乙氧基苯甲酸为原料,经过甲酯化和还原后,制备4-氨基-2-乙氧基苯甲酸甲酯;

步骤二、乙氧酰胺苯甲酯抗原的制备

采用重氮化法或戊二醛法,将步骤一制备的乙氧酰胺苯甲酯半抗原与载体进行偶联,合成制备乙氧酰胺苯甲酯包被原和免疫原;所述载体为卵清蛋白、牛血清白蛋白、甲状腺蛋白、血蓝蛋白、人血清白蛋白或多聚赖氨酸中的一种或两种;

步骤三、乙氧酰胺苯甲酯单克隆抗体的制备

将步骤二合成的免疫原与佐剂进行等体积比乳化,加入氧化石墨烯纳米颗粒或硅胶纳米颗粒,制备产乙氧酰胺苯甲酯单克隆抗体的杂交瘤细胞株;在杂交瘤细胞株制备过程中,加入人类干细胞因子、白介素-3、重组人类粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、人类碱性成纤维细胞生长因子和小鼠骨髓瘤细胞与脾细胞进行细胞融合,再加入杂交瘤细胞融合克隆因子,混匀后培养制得;将杂交瘤细胞株进行放大纯培养,生产制备乙氧酰胺苯甲酯单克隆抗体,保存、备用;

步骤四、试剂盒的组建

用包被缓冲液将步骤二制备的包被原稀释成0.1 -0.5mg/mL,100µL/孔加入酶标板中,

4℃过夜或37℃孵育2h-4h,倾去液体,洗涤液洗涤3 -5次,拍干,加入封闭液,37℃孵育2h-

4h,倾去孔中液体,拍干,室温在真空干燥箱干燥5h,铝箔袋真空塑封,得到含有包被原的酶标板;

将酶标板放入锡箔纸袋中,真空封装,与乙氧酰胺苯甲酯标准品溶液、标记抗体、乙氧酰胺苯甲酯单克隆抗体液、稀释液、洗涤液一同放入专用的包装盒中,置于4℃保存。

2.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于:步骤二所述与乙氧酰胺苯甲酯半抗原偶联的载体为卵清蛋白。

3.如权利要求书1所述的制备方法,其特征在于:步骤四所述包被缓冲液为0.05mol/L且pH 9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液;所述封闭液为含有质量分数为1%卵清蛋白的0.2mol/L且pH 7.4的磷酸盐缓冲液;所述洗涤液为含有体积分数为1.5%吐温的0.2mol/L且pH=7.4的磷酸盐缓冲液;所述稀释液为含有质量分数为0.05%-6%脱脂奶粉的0.02mol/L且pH=7.4的磷酸盐缓冲液。

4.如权利要求1-3任意一种所述制备方法制备的试剂盒,其特征在于:包括包被有乙氧酰胺苯甲酯抗原的酶标板、乙氧酰胺苯甲酯单克隆抗体液、标记抗体、乙氧酰胺苯甲酯标准品溶液、洗涤液和稀释液。

5.如权利要求4所述的试剂盒,其特征在于:所述标记抗体为经酶或荧光标记的羊抗鼠二抗抗体。

6.如权利要求4所述的试剂盒,其特征在于:所述荧光标记用的荧光标记物为高分子荧光微球、量子点、Alexa-Fluor系列荧光染料、罗丹明、二苯乙烯荧光染料、萘酰亚胺荧光染料、香豆素类荧光染料或藻胆蛋白中的一种。

7.如权利要求6所述的试剂盒,其特征在于:所述荧光标记物为Alexa-Fluor系列荧光染料中的Alexa Fluor 488。

8.利用权利要求4-7任意一种所述试剂盒检测乙氧酰胺苯甲酯残留的检测方法,其特征在于:首先对待测样品进行前处理;然后取出试剂盒,恢复至室温后按需要取出酶标板,向酶标板中加入50µL/孔的乙氧酰胺苯甲酯标准品溶液或待测样品溶液,再加入乙氧酰胺苯甲酯单克隆抗体液,振荡,混匀,25℃避光孵育30min,将孔内的液体甩干,再加入250µL/孔的洗涤液,如此洗涤4次,拍干;最后,加入50µL/孔的抗体标记物,25℃避光孵育30min,于特定波长测定吸光度值,然后进行定量或定性分析。

9.如权利要求8所述的检测方法,其中特征在于:对动物可食性组织进行样品前处理,具体步骤为:称取新鲜组织样品,剪碎,研磨,与pH7.4的磷酸盐缓冲液混匀,加入盐酸溶液,混合,超声波提取1h;冷却至室温后过滤,取滤液,加氢氧化钠溶液,混匀,再加磷酸二氢钾溶液,4℃放置1h,过滤,取滤液加入C18固相萃取小柱,用甲醇洗脱样品,水浴蒸干洗脱液,用蒸馏水溶解后进行检测。

10.如权利要求8所述的检测方法,其中特征在于:对饲料进行样品前处理,具体步骤为:称取样品,加入甲醇,涡旋,2000-7000g离心5min-15min,取上层有机相至离心管中,氮气吹干,加入正己烷,涡旋,震荡,加入三氯乙酸水溶液,混匀,涡旋,3000-8000g离心5min,取下层液体进行检测。