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专利号: 2017107358976
申请人: 浙江农林大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.在植物营养组织中异位表达的不同基因组合,其特征在于:含有所述的基因组合的表达载体引入以下模块:调控油脂合成的四种目的基因LEC2、DGAT1、OLEO2或GAT1中的至少一种;

控制目的基因均衡表达的转录单元;

多克隆位点。

2.如权利要求1所述的在植物组织中异位表达的不同基因组合,其特征在于:所述表达载体为含有LEC2、DGAT1、OLEO2和GAT1基因组合的载体。

3.如权利要求1或2所述的在植物营养组织中异位表达的不同基因组合,其特征在于:

所述表达载体中启动LEC2基因表达的启动子为35S,终止该基因表达的终止子为NOS;启动DGAT1基因表达的启动子为35S,终止该基因表达的终止子为At4g25710 基因的3’UTR;启动OLEO2基因表达的启动子为At4g25700基因的启动子,终止该基因表达的终止子为NOS;启动GAT1基因表达的启动子为35S,终止该基因表达的终止子为NOS。

4.如权利要求3所述的在植物营养组织中异位表达的不同基因组合,其特征在于:所述表达载体是以pBI121双元载体为骨架构建的。

5.如权利要求1所述的在植物营养组织中异位表达的不同基因组合,其特征在于:所述目的基因还包括与LEC2、DGAT1、OLEO2或GAT1的核苷酸序列同源性达到90%以上的基因;或包括编码的氨基酸序列与拟南芥中LEC2、DGAT1或OLEO2编码的氨基酸序列,或与酿酒酵母中GAT1编码的氨基酸序列同源性达到95%以上的基因。

6.如权利要求1所述的在植物营养组织中异位表达的不同基因组合,其特征在于:构建含有所述的基因组合的表达载体的方法,包括以下步骤:a、选择pBI121双元载体为构建骨架;在35S的5’端引入包括BamHI,XmaI,SmaI,XhoI和SacI的多克隆位点后将其插入pBI121中获得pBI121-35S;

b、扩增35S-NOS DNA片段;然后在35S-NOS DNA片段的5’端加入KpnI-ClaI-StuI多酶切位点,3’端加入HindIII-ClaI-EcoRI多酶切位点,再通过KpnI和EcoRI将35S-NOS DNA片段克隆到载体pYES2中,获得中间载体pYES2-35S-NOS;

c、以拟南芥基因组DNA为模板,扩增含有At4g25710 基因的3’UTR和At4g25700 基因的启动子(BCH1)及5’UTR的DNA片段,再在该DNA片段的5’端加入BamHI酶切位点,3’端加入SacI酶切位点,然后通过BamHI和SacI将该DNA片段插入到载体pYES2-35S-NOS中,获得中间载体pYES2-35S-3’UTR-BCH1-5’UTR-NOS;

d、以拟南芥的cDNA为模板,扩增OLEO2目的基因,然后在OLEO2目的基因的5’末端和3’末端均加上SacI单酶切位点,再通过单酶切位点SacI将OLEO2目的基因克隆到载体pYES2-

35S-3’UTR-BCH1-5’UTR-NOS,获得中间载体pYES2-35S-3’UTR-BCH1-5’UTR- OLEO2-NOS;

e、以拟南芥的cDNA为模板,扩增DGAT1目的基因,然后在DGAT1目的基因的5’末端和3’末端均加上BamHI单酶切位点,再通过单酶切位点BamHI将DGAT1目的基因克隆到载体pYES2-35S-3’UTR-BCH1-5’UTR-OLEO2-NOS,获得中间载体pYES2-35S-3’UTR-DGAT1-BCH1-

5’UTR-OLEO2-NOS,即pYES2-DGAT1-OLEO2;

f、以酵母基因组为模板,扩增GAT1目的基因,在GAT1目的基因的5’端引入酶切位点BamHI,3’端引入酶切位点XhoI,通过BamHI和XhoI将GAT1目的基因克隆到载体pBI121-35S,构成单基因表达载体pBI121-35S-GAT1;然后将中间载体pYES2-DGAT1-OLEO2中的基因片段DGAT1-OLEO2通过ClaI位点克隆到载体pBI121-35S-GAT1,获得三基因植物表达载体pBI121-DGAT1-OLEO2-GAT1;

g、以拟南芥的cDNA为模板,扩增LEC2目的基因,再在其3’端引入XbaI、5’端引入SacI,然后将LEC2目的基因克隆到pBI121-35S,构成单基因表达载体pBI121-LEC2;在扩增的LEC2目的基因的5’末端和3’末端均加上StuI单酶切位点,再通过单酶切位点StuI将LEC2目的基因克隆到三基因植物表达载体pBI121-DGAT1-OLEO2-GAT1,获得四基因表达载体pBI121-LEC2-DGAT1-OLEO2-GAT1。

7.如权利要求1所述的不同基因组合在提高植物营养组织油含量上的应用。

8.如权利要求7所述的应用,其特征在于:所述植物为烟草、大豆、油菜、向日葵、花生、玉米、高粱或苜蓿。

9.如权利要求1所述的不同基因组合在提高与植物营养组织中油合成与积累相关联的物质生产中的应用。

10.如权利要求9所述的应用,其特征在于:所述与植物营养组织中油合成与积累相关联的物质生产为脂溶性物质生产。