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专利号: 2017107887838
申请人: 辽宁大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.miR-24-1-5p在制备诊疗结直肠肿瘤生物制剂中的应用,其特征在于,所述的miR-

24-1-5p的成熟RNA序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,miR-24-1-5p作为分子标志物在检测miR-

24-1-5p在结直肠肿瘤组织中的表达中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,方法如下:取结直肠肿瘤组织样本,提取RNA,以RNA为模板,使用miRNA cDNA第一链合成试剂盒对miRNA进行加Poly(A)尾并反转录成cDNA,以cDNA为模板,分别加入针对mmu-miR-24-1-5p的特异性引物Fm和针对has-miR-

24-1-5p的特异性引物Fh,分别在荧光定量PCR仪上进行扩增,U6作为内参基因;通过荧光定量PCR分别测定组织样本中miR-24-1-5p扩增的CT值;

所述的特异性引物Fm序列为:5'-AGTGCCTACTGAGCTGATATCAGT-3';

所述的特异性引物Fh序列为:5’-GTGCCTACTGAGCTGATATCAGT-3’;

内参基因U6的引物Fu序列为:5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3';

PCR反应条件:95℃ 10分钟;95℃ 15秒;60℃ 1分钟,重复45个循环。

4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,miR-24-1-5p在制备治疗结直肠肿瘤药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述的miR-24-1-5p的制备方法包括如下步骤:

1)提取DNA;

2)以提取的DNA为模板,以特异性引物FORWARD和REVERSE进行PCR扩增,得到PCR产物;

FORWARD序列为:5'-CCGCTCGAGCAACAGGGTTTTCCAAGTCTAC-3';

REVERSE序列为:5’-GGAAGATCTTCACCTAAGTCGTGTGAAATCATGTGGTA-3’

PCR反应条件:94℃ 3分钟;98℃ 10秒;65℃ 1分钟;72℃ 10分钟重复35个循环;

3)将PCR产物和表达载体在XholⅠ和BglⅡ酶切位点进行双酶切,经酶切连接转化入表达载体,得到含miR-24-1-5p的重组质粒;

4)将含miR-24-1-5p的重组质粒导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中,得重组菌种,对重组菌种进行抗性筛选,得到稳定表达重组质粒的菌种。

6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,步骤2)获得的PCR产物的RNA序列如SEQ ID NO.3所示。

7.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述的表达载体为病毒表达载体或真核表达载体。

8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述的真核表达载体为pCMV-myc、pcDNA3.0、pcDNA3.1或pcDNA3.1-HA表达载体。