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专利号: 2017108659260
申请人: 浙江海洋大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 测量;测试
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种辨别鲤鱼三种肌肉细胞的组织学方法,包括冻结、切片、前处理、ATPase反应、发色、光学显微镜观察,其特征在于:所述的冻结步骤为:将从鲤鱼背部取的样品块用冷冻保护剂清洗后放在样品台上,滴加冰冻切片包埋剂,再将样品与样品台放入装有异戊烷的容器中,并将容器放入液氮中急速冷冻至冻结点即可;冷冻保护剂的浓度为2-3%,冷冻保护剂为海藻糖和糖苷,其重量比为

1:0.6-0.8,糖苷中左旋糖苷和右旋糖苷的比为1:83-92;

所述的切片步骤为:将达到冻结点后的样品在-20至-30℃下保持50-70min,然后切出厚度为9-11µm的切片,将收集切好的样品移至载玻片上,室温下干燥即得样品切片;

所述的前处理步骤为:将装有前处理溶液的前处理容器保持温度恒定,然后将样品切片放入前处理容器中处理,处理后倒出前处理溶液,再用清洗液清洗;

所述的ATPase反应步骤为:前处理切片中加入清洗液,然后放入18-22℃恒温槽中至温度恒定,再将清洗液完全倒出,立刻加入反应液反应,反应结束后将反应液倒出,立即加入蒸馏水清洗3-4次,再加入蒸馏水浸渍1-2min,重复浸渍6-8次,即得ATPase反应切片;

所述的发色步骤为:将ATPase反应切片用CaCl2溶液浸泡后用蒸馏水清洗,浸渍;然后加入CoCl2溶液浸泡,结束后用蒸馏水清洗,浸渍;再用硫化铵溶液浸泡,倒出硫化铵溶液后,结束后用蒸馏水清洗,浸渍,即得发色切片;

所述的光学显微镜观察步骤为:取出发色切片,吸取多余水分,盖上盖玻片,甘油封片后,利用光学显微镜进行观察,即可辨别鲤鱼三种肌肉细胞;

所述的前处理步骤中前处理溶液含有0.09-0.11M抑胰肽酶缓冲液和17-19mMCaCl2,前处理溶液的pH为10.40-10.60;

所述的前处理步骤中清洗液的组成为:17-19mMCaCl2、48-52mMKCl和0.09-0.11M2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液,清洗液的pH为9.35-9.45,清洗2-3次,每次清洗13-16min;

所述的ATPase反应步骤中反应液的组成为:17-19mMCaCl2、48-52mMKCl、3.0-3.2mM ATP和0.09-0.11M 2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液,反应液的pH为9.35-9.45,反应液的温度为

18-22℃,反应时间为25-35min。

2.根据权利要求1所述的一种辨别鲤鱼三种肌肉细胞的组织学方法,其特征在于:所述的前处理步骤中恒温温度为18-22℃,样品切片恒温处理20-30min。

3.根据权利要求1所述的一种辨别鲤鱼三种肌肉细胞的组织学方法,其特征在于:所述的发色步骤中CaCl2溶液浓度为0.8-1.1%,浸泡3-4min;CoCl2溶液浓度为1.8-2.1%,浸泡3-

4min;硫化铵溶液浓度为0.8-1.1%,浸泡50-70s。