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专利号: 2017109350822
申请人: 浙江海洋大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.小球藻邻苯二酚1,2-双加氧酶的提取,包括胞内酶粗酶液制备、浓缩透析、首次纯化、二次纯化,其特征在于:所述的胞内酶粗酶液制备步骤为:将对数期后期小球藻液抽滤,烘干得小球藻粉,研磨,再加入Tris-HCl缓冲液,混合均匀后离心,上清液即为胞内酶粗酶液。

2.根据权利要求1所述的小球藻邻苯二酚1,2-双加氧酶的提取,其特征在于:所述的胞内酶粗酶液制备步骤中研磨温度为2-5℃,时间为5-15min。

3.根据权利要求1所述的小球藻邻苯二酚1,2-双加氧酶的提取,其特征在于:所述的胞内酶粗酶液制备步骤中Tris-HCl缓冲液的pH为7.8-8.2,小球藻粉与Tris-HCl缓冲液的重量体积比为1:1.8-2.3。

4. 根据权利要求1所述的小球藻邻苯二酚1,2-双加氧酶的提取,其特征在于:所述的浓缩透析步骤为:将胞内酶粗酶液经微孔滤膜过滤,再用聚乙二醇PEG 20000浓缩,并用磷酸盐缓冲液透析,即得邻苯二酚1,2-双加氧酶的粗品。

5.根据权利要求4所述的小球藻邻苯二酚1,2-双加氧酶的提取,其特征在于:所述的浓缩透析步骤中微孔滤膜的孔径为0.15-0.3μm。

6.根据权利要求4所述的小球藻邻苯二酚1,2-双加氧酶的提取,其特征在于:所述的浓缩透析步骤中磷酸盐缓冲液的浓度为9-11mmol/L、pH为6.8-7.2,透析12-18h。

7. 根据权利要求1所述的小球藻邻苯二酚1,2-双加氧酶的提取,其特征在于:所述的首次纯化步骤为:将邻苯二酚1,2-双加氧酶粗品上样到平衡后的纤维素柱上,磷酸缓冲液洗脱,再用聚乙二醇PEG 20000浓缩,并用磷酸缓冲液透析,最后用超滤膜再次浓缩即可。

8.根据权利要求1所述的小球藻邻苯二酚1,2-双加氧酶的提取,其特征在于:所述的二次纯化步骤为:用含有0.11-0.13mmol/L水合肼、浓度为4-6mmol/L、pH为7.3-7.7的磷酸缓冲液对Mono-Q柱平衡后,将首次纯化后的邻苯二酚1,2-双加氧酶粗品上样,用磷酸缓冲液洗脱,透析,最后用超滤膜浓缩,干燥,即得邻苯二酚1,2-双加氧酶。

9.小球藻邻苯二酚1,2-双加氧酶的活性测定,其特征在于:所述的活性测定为:将反应体系在20-30℃水浴中反应30min,每5min取样一次,测定产物的生成量。

10. 根据权利要求9所述的小球藻邻苯二酚1,2-双加氧酶的活性测定,其特征在于:所述的反应体系为:30-50mmol/L的EDTA 0.18-0.22mL、20-40mmol/L的邻苯二酚0.019-

0.021mL、小球藻邻苯二酚1,2-双加氧酶0.3-0.5mg、0.04-0.06mol/L、pH为6.8-7.2的磷酸缓冲液1.35-1.40mL。