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专利号: 2017109455839
申请人: 山东师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-07-12
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种检测Dam甲基转移酶的荧光化学传感器,其特征在于,所述荧光化学传感器包括:Dam甲基转移酶检测探针和辅助探针;

其中,所述Dam甲基转移酶检测探针为一个具茎环结构的发夹DNA探针,两条茎结构互补形成双链DNA,所述双链DNA具有Dam甲基转移酶的识别位点;所述发夹DNA探针3'末端使用氨基修饰;

所述Dam甲基转移酶的识别位点为5'-G-A-T-C-3'的回文序列;

所述辅助探针为一个近3'末端具有脱嘌呤嘧啶位点的富T单链DNA序列,所述辅助探针

3'末端使用氨基修饰;

所述荧光化学传感器还包括依赖甲基化的内切酶DpnI、末端转移酶、核酸内切酶IV和三磷酸脱氧腺苷。

2.如权利要求1所述的一种荧光化学传感器,其特征在于,所述Dam甲基转移酶检测探针长度为37nt,所述Dam甲基转移酶检测探针的碱基序列为:5'-GAA GGA TCT TCT CGA CTT GCT GAA GAT CCT TCT TAA T-NH2-3';所述Dam甲基转移酶检测探针3'端进行氨基修饰。

3.如权利要求1所述的一种荧光化学传感器,其特征在于,所述辅助探针长度为26nt,所述辅助探针的碱基序列为5'-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTX TTT TT-NH2-3',其中X代表脱嘌呤嘧啶位点,所述辅助探针3'端进行氨基修饰。

4.如权利要求1所述的一种荧光化学传感器,其特征在于,所述荧光化学传感还包括荧光指示剂,优选的,所述荧光指示剂为SYBR Gold。

5.如权利要求1所述的一种荧光化学传感器,其特征在于,所述荧光化学传感还包括Dam甲基转移酶反应缓冲液,所述Dam甲基转移酶反应缓冲液包括:50毫摩尔每升Tris-HCl缓冲液,10毫摩尔每升EDTA,5毫摩尔每升2-巯基乙醇,pH 7.5。

6.如权利要求1所述的一种荧光化学传感器,其特征在于,所述荧光化学传感还包括末端转移酶缓冲液,所述末端转移酶缓冲液包括:50毫摩尔每升醋酸钾,20毫摩尔每升Tris-Ac,10毫摩尔每升醋酸镁,pH 7.9。

7.权利要求1-5任一项所述荧光化学传感器用于Dam甲基转移酶检测的方法,其特征在于,步骤包括:

1)将待测样品加入反应溶液I中进行孵育反应,然后进行高温灭活处理;

2)向步骤1)高温灭活处理后的溶液中加入反应溶液II进行聚合反应;

3)对步骤2)反应后的溶液进行荧光化学检测,实现对待测样品中Dam甲基转移酶的定量分析。

8.如权利要求7所述的一种检测方法,其特征在于,步骤1)所述反应溶液I中包括Dam甲基转移酶检测探针,S-腺苷甲硫胺酸,限制性核酸内切酶DpnⅠ和Dam甲基转移酶反应缓冲液;

步骤1)中孵育反应条件为:37℃,孵育时间为1.5~3h(优选为2h);高温灭活处理温度为80℃,处理时间为10~30min(优选为20min)。

9.如权利要求7所述的一种检测方法,其特征在于,步骤2)中所述反应溶液II包括辅助探针,三磷酸脱氧腺苷,末端转移酶,核酸内切酶IV,二氯化钴和末端转移酶缓冲液和SYBR Gold。

10.权利要求1-6任一项所述荧光化学传感器和/或权利要求7-9任一项所述检测方法在定量检测在定量检测Dam甲基转移酶和/或筛选Dam甲基转移酶抑制剂/激活剂中的应用。