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专利号: 2017112074391
申请人: 江西农业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-12-04
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种用于黄连分子鉴定的标准基因数据库,其特征在于,核苷酸序列为序列表中的序列,包括黄连属植物的ycf1序列矩阵,该矩阵包含全球已知的19种黄连属植物。

2.一种基于权利要求1的黄连的分子鉴定方法,其特征在于,其包括以下步骤,步骤一:样品总DNA提取;

步骤二:PCR扩增ycf1基因片段;

步骤三:对ycf1序列测序结果进行拼接,获得ycf1基因片段;

步骤四:构建样品的ycf1序列NJ树;

步骤五:根据NJ树判断。

3.根据权利要求2所述的一种黄连的分子鉴定方法,其特征在于,其包括以下步骤,步骤一:DNA提取:剪取干燥的样品100mg,然后磨成粉末,提取总DNA,对所获得的植物基因组总DNA进行检测,检测其DNA浓度以及是否降解;

步骤二:PCR扩增及测序:PCR扩增后,检测扩增产物的浓度,浓度合格后进行双向测序;

步骤三:序列校正与比对:将DNA测序返回的序列峰图文件进行校正、比对,比对完成后删除两端不可信区域,将获得的序列填加到黄连属植物ycf1基因标准数据库中,进行比对,比对完成后保存序列矩阵,获得ycf1基因片段;

步骤四:构建NJ树:将比对拼接完成的序列,基于K-2P模型,构建邻接树,并通过1000次自展检验确定每一分支的支持率;

步骤五:鉴定判断:如果待测样品ycf1序列与药典规定的3种中药黄连药材之一的黄连、三角叶黄连或云南黄连的序列聚类在一起,则说明该样品为中药黄连,否则排除该样品用作中药黄连。

4.根据权利要求3所述的一种黄连的分子鉴定方法,其特征在于,其包括以下步骤,步骤一:DNA提取:剪取干燥的样品100mg,然后用震荡磨样机磨成粉末,用改良CTAB法提取总DNA,对于DNA得率、纯度低的样品一起采用DNeasy Plant Mini Kit试剂盒提取总DNA,所获得的植物基因组总DNA均用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测,检测其DNA浓度以及是否降解;

步骤二:PCR扩增及测序:PCR扩增后,用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的浓度,浓度合格进行双向测序;

步骤三:序列校正与比对:将DNA测序返回的序列峰图文件导入Sequencher 4.1.4软件中进行正反向序列自动拼接、编号、人工校正,完成后输出为文本格式导入BioEdit软件中进行同片段个体间比对,根据序列峰图对比对结果进行进一步确认确保所有序列差异均为真实变异,比对完成后删除两端不可信区域,将获得的序列填加到黄连属植物ycf1基因标准数据库中,在BioEdit软件中进行插入、缺失及变异位点的比对,比对完成后保存序列矩阵,获得ycf1基因片段;

步骤四:构建NJ树:将比对拼接完成的序列文件输入MEGA 7软件中,基于K-2P模型,构建邻接树,并通过1000次自展检验确定每一分支的支持率;

步骤五:鉴定判断:如果待测样品ycf1序列与药典规定的3种中药黄连药材之一的黄连、三角叶黄连或云南黄连的序列聚类在一起,则说明该样品为中药黄连,否则排除该样品用作中药黄连。

5.根据权利要求4所述的一种黄连的分子鉴定方法,其特征在于,所述步骤二中PCR特异扩增引物对为:正向ycf1-F:5'-TCTCGAAAATCAGATTGTTGT-3'

反向ycf1-R:5'-ATGTCAAAGTGATGGAAAA-3'。

6.根据权利要求4所述的一种黄连的分子鉴定方法,其特征在于:所述步骤二中PCR反应体系为:DNA模板2μl,10×Dream Taq Green buffer 5μl,dNTP Mix 5μl,DMSO(二亚甲基亚砜)2μl,BSA(牛血清蛋白)0.5μl,正向引物2μl,反向引物2μl,Dream Taq DNA Ploymrerase 1.5μl,双蒸水加注至50μl。

7.根据权利要求4所述的一种黄连的分子鉴定方法,其特征在于:所述步骤二中PCR扩增程序为:95℃预变性3分钟,95℃变性30秒,52℃退火30秒,72℃扩增1分钟,共30个循环,最终72℃终扩增10分钟。

8.根据权利要求1所述的一种黄连的分子鉴定方法,其特征在于:所述ycf1序列校正比对后的总长度为823bp。

9.根据权利要求1所述的一种黄连的分子鉴定方法,其特征在于:鉴定的黄连为黄连属野生植物或栽培植物的干燥或新鲜的根、茎,叶、花、果实、种子。