1.一种耐热突变脂肪酶,其特征在于:是在耶氏解脂酵母脂肪酶2中通过迭代组合的方法引入多对二硫键突变获得;所述的引入多对二硫键为引入4~6对二硫键。
2.根据权利要求1所述的耐热突变脂肪酶,其特征在于:所述的耐热突变脂肪酶为脂肪酶4s、脂肪酶5s或脂肪酶6s;
脂肪酶4s的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示;
脂肪酶5s的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示;
脂肪酶6s的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.编码权利要求2所述的耐热突变脂肪酶的核苷酸序列,其特征在于:所述的脂肪酶4s的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示;
所述的脂肪酶5s的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示;
所述的脂肪酶6s的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
4.权利要求1所述的耐热突变脂肪酶的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:(1)以pPICZαA-Lip2为模板,通过反向PCR突变,将所选的氨基酸位点突变为半胱氨酸,并转入大肠杆菌中,进行扩增培养、质粒提取和测序,获得引入四对、五对或六对二硫键的突变脂肪酶重组质粒;
(2)将测序正确的重组质粒以PmeⅠ限制性内切酶线性化处理,并电击转化至感受态毕赤酵母X33中,进一步通过YPDS-Zeocin平板筛选,得到对应的突变工程菌;
(3)将突变工程菌在YPD液体培养基中进行扩繁培养后,转接至BMGY液体培养基进行去抑制培养,最后接种BMMY液体培养基进行发酵,将菌液离心获取上清粗酶液;
(4)利用超滤管将粗酶液进行超滤浓缩后,使用镍柱一步法纯化,分离出带组氨酸标签的脂肪酶蛋白,并以还原性SDS-PAGE检测蛋白纯度,获取纯化后的耐热突变脂肪酶。
5.根据权利要求4所述的耐热突变脂肪酶的制备方法,其特征在于:步骤(1)中所述的大肠杆菌为大肠杆菌TOP10。
6.根据权利要求4所述的耐热突变脂肪酶的制备方法,其特征在于:步骤(2)中所述的YPDS-Zeocin平板中Zeocin的浓度为100μg/mL。
7.根据权利要求4所述的耐热突变脂肪酶的制备方法,其特征在于还包括如下步骤:(5)通过DSF荧光检测测定脂肪酶的熔解温度,p-NPP比色法测定15min半失活温度,55或70℃下的半衰期,最适反应温度,最适反应pH,以及pH稳定性。
8.权利要求1或2所述的耐热突变脂肪酶在工业中的应用。