1.一种高灵敏度的铅离子检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)样品处理:先将待测样品经0.22μm的超微滤膜过滤,再分别稀释10倍、20倍、50倍、
100倍、500倍和1000倍,得样品稀释液;
(2)引物制备:将样品稀释液分别加入GR-5脱氧核酶中至体积为40μL,于25℃孵育切割
3min,再加入5μL终止液,混合均匀,于4℃进行保存,得引物单链X;
(3)互补杂交:分别吸取3μL引物单链X、3μL质量浓度为1μM模板链X’-Y’、3μL质量浓度为2.5mM的dNTPs、15.2μL超纯水,混合均匀,先于95℃孵育5min,得杂交链;
(4)等温扩增:向杂交链中加入5.8μL复合酶溶液,于55℃孵育8min,再置于95℃保温
10min,置于-20℃备用,得单链Y-G4-DNA;
(5)模拟酶制备:分别吸取10μL单链Y-G4-DNA、30μL酶活缓冲液、60μL血红素Hemin稀释溶液,混合均匀,于37℃保温反应30min,得模拟酶Hemin-G4;
(6)催化显色:向模拟酶Hemin-G4中加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)显色液50μL,混合均匀,于37℃恒温反应10min,再加入50μL质量浓度为2M的硫酸溶液,混合均匀,于
450nm处检测吸光值,得450nm吸光值;
(7)铅离子浓度计算:将450nm吸光值带入线性回归方程,得铅离子浓度。
2.根据权利要求1所述高灵敏度的铅离子检测方法,其特征在于,所述步骤(2)中的GR-
5脱氧核酶的制备方法,包括以下步骤:分别取质量浓度为10μM的GR-5-底物链4μL,质量浓度为10μM的GR-5-酶链4μL,加入缓冲液和水至40μL,使缓冲液中NaHEPES质量浓度为50mM、NaCl质量浓度为50mM、MgCl2质量浓度为5mM,pH为7.26,于95℃加热14 16min,然后缓慢降~至24 26℃,得GR-5脱氧核酶。
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3.根据权利要求1所述高灵敏度的铅离子检测方法,其特征在于,所述步骤(2)中的终止液,由以下质量浓度的原料制成:EDTA 0.2M、NaCl 2M、Tris 0.5M。
4. 根据权利要求1所述高灵敏度的铅离子检测方法,其特征在于,所述步骤(4)中的复合酶溶液,由以下重量份的原料制成:8U/μL的Bst DNA聚合酶0.1μL、10×的聚合酶反应缓冲溶液3μL、质量浓度为10U/μL的Nt.BstNBI切刻内切酶1.2μL、10×的Nt.BstNBI切克内切酶反应缓冲溶液1.5μL。
5.根据权利要求1所述高灵敏度的铅离子检测方法,其特征在于,所述步骤(5)中的酶活缓冲液,由以下质量浓度的原料制成:Tris 100mM、NaCl 120mM、MgCl2 10mM、KCl 100mM,pH为8.4。
6.根据权利要求1所述高灵敏度的铅离子检测方法,其特征在于,所述步骤(5)中的血红素Hemin稀释溶液,吸取2μL Hemin原液,加入所述的酶活缓冲液1mL,混合均匀,得血红素Hemin稀释溶液。