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专利号: 2018100548442
申请人: 陕西师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种特异性靶向hDGKθ基因的荧光素酶报告系统的建立方法,其特征在于,按下列步骤进行:

(1)筛选靶向hDGKθ基因3′非编码区的sgRNA从NCBI查找hDGKθ基因的基因组序列,在位于终止密码子之后的非编码区选择四个sgRNA结合位点并设计相应的sgRNA引物,将sgRNA引物退火后连接到Cas9表达载体,转染HEK293细胞,转染72小时后,提取基因组DNA,对打靶区域进行PCR扩增,利用T7E1法筛选具有最高切割活性的sgRNA;

(2)构建携带Cas9和靶向hDGKθ基因的sgRNA的打靶载体将筛选获得的靶向DGKθ基因的sgRNA表达元件、Cas9表达元件依次连入真核表达载体,获得pCas9‑DGKθsgRNA;

(3)构建携带上下游同源臂及外源DNA片段的打靶供体以人源化细胞基因组为模板,PCR扩增上、下游同源臂,依次连入携带T2A‑Luciferase cDNA‑CMV‑eGFP‑T2A‑Neomyci‑SV40pA元件的表达载体的两端;

(4)将打靶载体与打靶供体共同导入细胞,用筛选基因筛选,将筛选稳定后的细胞进行克隆化,对克隆化后的细胞克隆进行测序鉴定;

其中:所述的四个sgRNA结合位点分别为:

SgRNA1:CCCGCCCTCATCCCATTGGTGA,SgRNA2:TGTTACCCCGTGTCCCGGGTGGG,SgRNA3:TGATCTCACTTTGTGCCCCTCGG,和SgRNA4:CTGGTGACTTCCTTGTGTTCAGG;

所述的上游同源臂的序列如下所示:

ACACCAGGTTTGAGAAGCCACGCATGGACGACGGGCTGCTGGAG GTTGTGGGCGTGACGGGCGTCGTGCACATGGTGAGCCGCCGGCCGAGTGGGCGGGCGAGCCCAGGGTGGGCGTCCCCGGTCCCCGCTGAGCCCAGCTGGCCTCTCCCGCCCCAGGGCCAGGTCCAGGGTGGGCGTCCCCGGTCCCCGCTGAGCCCGGCTGGCCTCTCCCGCCCCAGGGCCAGGTCCAGGGTGGGCGTCCCTGGTCCCTGCTCGGCTGGCCTCTCCCGCCCCAGGGCCAGGTCAGCGGTGGGCGTCCCTGATCCCCGCTGAGCCCGGCTGGCCTCTCCCGCCCCAGGGCCAGGTCCAGGGTGGGCTGCGCTCCGGAATCCGGATTGCCCAGGGTTCCTACTTCCGAGTCACGCTCCTCAAGGCCACCCCGGTGCAGGTGGACGGGGAGCCCTGGGTCCAGGCCCCGGGGCACATGATCATCTCAGCTGCTGGCCCTAAGGTATGTGGGGTGAGGCTGGAGAGCCAGGGGAGGTGGGCCGGGCTGGGCCGGCCATGGGAGTGGCCAGTGGTACCCAGGTGGTGCTGGCATGGCCGGCTGCGGCCAGGGAGCACTGACTCCGGGAGGGTGCCTGCTTCAGAGGAGGGCTGTGCCAGTGGCCAGGCGGGCCACAGGTGGCACAGGGAGCAGCCAGACAGGTCCCTCCCCTTCCGTGAAATGGGGCTGAGATGGCATCAGCTGCCCGGGGCCCCAGGACCGGGGGCTGCCCGTGTACCGTTCTTTCATCGGCCATGTCACCCTGGTCCTCTGTCCCCTGCCCTGGGACAGGTGCACATGCTGAGGAAGGCCAAGCAGAAGCCGAGGAGGGCCGGGACCACCAGGGATGCCCGGGCGGATGCTGCGCCTGCCCCTGAGAGCGATCCTAGG;

所述下游同源臂的序列如下所示:

AGGCTAGGAGGTCTCAGGTGCTGCCCTGGCAGCACCAGAGTGTGGGCCGGGCCCGAGTGTCTGCCCCTCGGCCCTCAGGGTGGGGCACTTAGCACCCAGAAGGGACCAAAAGCAGGGCATGGCGGTGCAGAGGAGTTTGGGAGGTGTAAACAGCCCATGCACGTGGAGGAGGAGCTGGCTTTCAGCCCCAGACCCCACGCTAGCACTTTCCACGCTGCTTGCCCGCTGTTGATGT GCAGTTCCCAGTGCCTGTGTGAGCCGACATCTGCTCAGTCCTATCCCTCGTCAGCGTGTGGAGACCCAGCTCCTGCAGCCCTCCTGCTCCCACGCCCCCAGACAGCTTGGTGGAGGGTCCTGCATCTGGGCCAGGCTGGGGTGCACCCAGCCAAAGACAAAGCTGCCTCCACGTGCCCAAGGATTCAGATGGTGCACTGGCCCCGGGAGGAGTCTGACCAAAAATGGAGCCCGCTCTGTGGGGAAGCCCCGACTCCCCCACGAGAAACGGTCCCACGGTGCGGATCTCCCCCTTCCCTTGTGGGGCACAGCTGGCCTGGGCCTCCAATCCTGCGGAGCTTTCCTGGGTGTGGCTTTGACCTCAGAAGTGGCTCTGGTTTGGCCTCAGGAGTGTGGCCTGGCCCAGCCTGCTGCAGCCTCCTGGGGGGCCCTTGATGCCACTAATCCCCCGACCCCCCGCATCTGCCAAACTGCACAGACACACG;

利用所述建立方法构建的特异性靶向hDGKθ基因的荧光素酶报告系统,荧光素酶基因可以被定点整合到hDGKθ基因下游,在自剪切小肽介导下,与hDGKθ基因同时受hDGKθ启动子转录起始,实现了荧光素酶活性与内源性靶基因hDGKθ活性直接相关;从而能够筛选对DGKθ基因具有转录调控作用的上游转录因子或者小分子药物;能促进hDGKθ在相关的神经系统性疾病及代谢性疾病治疗中作为潜在靶标的研究。