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专利号: 2018100548442
申请人: 陕西师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种特异性靶向hDGKθ基因的荧光素酶报告系统,其特征在于,该特异性靶向hDGKθ基因的荧光素酶报告系统由打靶载体和打靶供体两部分组成,其中:所述打靶供体携带需要引入的外源DNA片段,该外源DNA片段包括荧光素酶基因cDNA序列、eGFP表达框、Neomycin基因序列和上、下游同源臂片段;

所述的打靶载体含有核酸酶Cas9表达框,同时还含有靶向hDGKθ的引导链sgRNA表达框。

2.如权利要求1所述的特异性靶向hDGKθ基因的荧光素酶报告系统,其特征在于,所述的靶向hDGKθ的引导链sgRNA,其识别位点靠近hDGKθ基因的3′端,位于hDGKθ基因终止密码子的下游。

3.如权利要求1所述的特异性靶向hDGKθ基因的荧光素酶报告系统,其特征在于,所述的靶向是指将荧光素酶报告基因定点整合于hDGKθ基因组下游,使其受内源性DGKθ基因启动子的调控。

4.如权利要求1所述的特异性靶向hDGKθ基因的荧光素酶报告系统,其特征在于,所述的上、下游同源臂是长度为500到1000bp的DNA片段,分别与基因组上hDGKθsgRNA识别位点上、下游的部分基因组序列同源。

5.权利要求1至4其中任一所述的特异性靶向hDGKθ基因的荧光素酶报告系统的建立方法,其特征在于,按下列步骤进行:

(1)筛选靶向hDGKθ基因3′非编码区的sgRNA

从NCBI查找hDGKθ基因的基因组序列,在位于终止密码子之后的非编码区选择四个sgRNA结合位点并设计相应的sgRNA引物,将sgRNA引物退火后连接到Cas9表达载体,转染HEK293细胞,转染72小时后,提取基因组DNA,对打靶区域进行PCR扩增,利用T7E1法筛选具有最高切割活性的sgRNA;

(2)构建携带Cas9和靶向hDGKθ基因的sgRNA的打靶载体

将筛选获得的靶向hDGKθ基因的sgRNA连入商业化载体U6/sgRNA表达载体,获得pU6-sgRNA。再将Cas9表达元件连入pU6-sgRNA表达载体,获得pCas9-hDGKθsgRNA;

(3)构建携带上下游同源臂及外源DNA片段的打靶供体

以人源化细胞基因组为模板,PCR扩增上、下游同源臂,依次连入携带T2A-LuciferasecDNA-CMV-eGFP-T2A-Neomyci-SV40pA元件的表达载体的两端;

(4)将打靶载体与打靶供体共同导入细胞用筛选基因筛选,将筛选稳定后的细胞进行克隆化,对克隆化后的细胞克隆进行测序鉴定。

6.如权利要求5所述的方法,其特征在于,所述的四个sgRNA位点分别为:

SgRNA1:CCCGCCCTCATCCCATTGGTGA;

SgRNA2:TGTTACCCCGTGTCCCGGGTGGG;

SgRNA3:TGATCTCACTTTGTGCCCCTCGG;

SgRNA4:CTGGTGACTTCCTTGTGTTCAGG。

7.如权利要求5所述的方法,其特征在于,所述的上游同源臂的序列如下所示:

ACACCAGGTTTGAGAAGCCACGCATGGACGACGGGCTGCTGGAGGTTGTGGGCGTGACGGGCGTCGTGCACATGGTGAGCCGCCGGCCGAGTGGGCGGGCGAGCCCAGGGTGGGCGTCCCCGGTCCCCGCTGAGCCCAGCTGGCCTCTCCCGCCCCAGGGCCAGGTCCAGGGTGGGCGTCCCCGGTCCCCGCTGAGCCCGGCTGGCCTCTCCCGCCCCAGGGCCAGGTCCAGGGTGGGCGTCCCTGGTCCCTGCTCGGCTGGCCTCTCCCGCCCCAGGGCCAGGTCAGCGGTGGGCGTCCCTGATCCCCGCTGAGCCCGGCTGGCCTCTCCCGCCCCAGGGCCAGGTCCAGGGTGGGCTGCGCTCCGGAATCCGGATTGCCCAGGGTTCCTACTTCCGAGTCACGCTCCTCAAGGCCACCCCGGTGCAGGTGGACGGGGAGCCCTGGGTCCAGGCCCCGGGGCACATGATCATCTCAGCTGCTGGCCCTAAGGTATGTGGGGTGAGGCTGGAGAGCCAGGGGAGGTGGGCCGGGCTGGGCCGGCCATGGGAGTGGCCAGTGGTACCCAGGTGGTGCTGGCATGGCCGGCTGCGGCCAGGGAGCACTGACTCCGGGAGGGTGCCTGCTTCAGAGGAGGGCTGTGCCAGTGGCCAGGCGGGCCACAGGTGGCACAGGGAGCAGCCAGACAGGTCCCTCCCCTTCCGTGAAATGGGGCTGAGATGGCATCAGCTGCCCGGGGCCCCAGGACCGGGGGCTGCCCGTGTACCGTTCTTTCATCGGCCATGTCACCCTGGTCCTCTGTCCCCTGCCCTGGGACAGGTGCACATGCTGAGGAAGGCCAAGCAGAAGCCGAGGAGGGCCGGGACCACCAGGGATGCCCGGGCGGATGCTGCGCCTGCCCCTGAGAGCGATCCTAGG。

8.如权利要求5所述的方法,其特征在于,所述下游同源臂的序列如下所示:

AGGCTAGGAGGTCTCAGGTGCTGCCCTGGCAGCACCAGAGTGTGGGCCGGGCCCGAGTGTCTGCCCCTCGGCCCTCAGGGTGGGGCACTTAGCACCCAGAAGGGACCAAAAGCAGGGCATGGCGGTGCAGAGGAGTTTGGGAGGTGTAAACAGCCCATGCACGTGGAGGAGGAGCTGGCTTTCAGCCCCAGACCCCACGCTAGCACTTTCCACGCTGCTTGCCCGCTGTTGATGTGCAGTTCCCAGTGCCTGTGTGAGCCGACATCTGCTCAGTCCTATCCCTCGTCAGCGTGTGGAGACCCAGCTCCTGCAGCCCTCCTGCTCCCACGCCCCCAGACAGCTTGGTGGAGGGTCCTGCATCTGGGCCAGGCTGGGGTGCACCCAGCCAAAGACAAAGCTGCCTCCACGTGCCCAAGGATTCAGATGGTGCACTGGCCCCGGGAGGAGTCTGACCAAAAATGGAGCCCGCTCTGTGGGGAAGCCCCGACTCCCCCACGAGAAACGGTCCCACGGTGCGGATCTCCCCCTTCCCTTGTGGGGCACAGCTGGCCTGGGCCTCCAATCCTGCGGAGCTTTCCTGGGTGTGGCTTTGACCTCAGAAGTGGCTCTGGTTTGGCCTCAGGAGTGTGGCCTGGCCCAGCCTGCTGCAGCCTCCTGGGGGGCCCTTGATGCCACTAATCCCCCGACCCCCCGCATCTGCCAAACTGCACAGACACACG。