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专利号: 2018101718686
申请人: 江南大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-10-10
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种积累N-乙酰神经氨酸的重组谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum),其特征在于,将N-乙酰神经氨酸合成途径5个基因:氨糖-果糖-6磷酸氨基转移酶编码基因、氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因、磷酸酶编码基因、乙酰氨基葡萄糖异构酶编码基因、外源N-乙酰神经氨酸合酶编码基因,在谷氨酸棒杆菌中进行表达,实现N-乙酰神经氨酸的积累;宿主菌为敲除了N-乙酰神经氨酸转运蛋白编码基因cg2937以及N-乙酰氨基甘露糖激酶编码基因nanK、N-乙酰氨基甘露糖-6-磷酸异构酶编码基因nanE、乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰基酶编码基因nagA和氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨基酶编码基因nagB的谷氨酸棒杆菌ATCC13869△cg2937△nanK△nanE△nagA△nagB。

2.根据权利要求1所述的一种积累N-乙酰神经氨酸的谷氨酸棒杆菌,其特征在于,氨糖-果糖-6磷酸氨基转移酶编码基因来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869,和/或氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S288C,和/或磷酸酶编码基因来源于大肠杆菌(Escherichia coli)K-12,和/或乙酰氨基葡萄糖异构酶编码基因来源于项圈藻(Anabaena sp.)CH1,和/或N-乙酰神经氨酸合酶编码基因来源于大肠杆菌(Escherichia coli)K-1。

3.权利要求1或2所述的一种积累N-乙酰神经氨酸的谷氨酸棒杆菌的构建方法,其特征在于,以表达载体pDXW-9构建携带氨糖-果糖-6磷酸氨基转移酶编码基因、氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因、磷酸酶编码基因、乙酰氨基葡萄糖异构酶编码基因、外源N-乙酰神经氨酸合酶编码基因的重组表达载体。

4.根据权利要求3所述的一种积累N-乙酰神经氨酸的谷氨酸棒杆菌的构建方法,其特征在于,age、neuB基因连接至pDXW-9表达载体上的EcoRI和HindIII酶切位点之间;glmS、GNA1、yqaB基因连接至pDXW-9表达载体上的NheI和HindIII酶切位点之间。

5.根据权利要求3或4所述的一种积累N-乙酰神经氨酸的谷氨酸棒杆菌的构建方法,其特征在于,敲除所述谷氨酸棒杆菌的N-乙酰神经氨酸转运蛋白编码基因cg2937,是通过构建含有N-乙酰神经氨酸转运蛋白编码基因敲除框的自杀质粒,经同源重组将敲除框替代谷氨酸棒杆菌染色体上N-乙酰神经氨酸转运蛋白编码基因cg2937,以阻断N-乙酰神经氨酸由胞外向胞内的转运。

6.根据权利要求5所述的一种积累N-乙酰神经氨酸的谷氨酸棒杆菌的构建方法,其特征在于,敲除所述谷氨酸棒杆菌的N-乙酰氨基甘露糖激酶编码基因nanK、N-乙酰氨基甘露糖-6-磷酸异构酶编码基因nanE、乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰基酶编码基因nagA和氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨基酶编码基因nagB,是通过构建含有N-乙酰神经氨酸操纵子5’-nagB-nagA-nanA-nanK-nanE-3’敲除框的自杀质粒,经同源重组将敲除框替代谷氨酸棒杆菌染色体上N-乙酰神经氨酸操纵子5’-nagB-nagA-nanA-nanK-nanE-3’,再在5’-nagB-nagA-nanA-nanK-nanE-3’敲除框中插入nanA基因,经同源重组将染色体上的nanA基因复原,以阻断N-乙酰神经氨酸在胞内的分解代谢。

7.一种应用权利要求1或2所述重组谷氨酸棒杆菌发酵生产N-乙酰神经氨酸的方法,其特征在于,将30-32℃、180-220rpm下培养12-24h的种子液以5%-10%的接种量转入发酵培养基,于30-32℃、180-220rpm条件下培养30-50h。

8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,

种子培养基(g/L):葡萄糖10,尿素1.25,玉米浆20,磷酸二氢钾1,硫酸镁0.5;发酵培养基(g/L):葡萄糖80,硫酸铵35,玉米浆20,磷酸二氢钾1,硫酸镁1,碳酸钙30。