1.一种基于代谢组学的广西瑶山甜茶抗糖尿病潜在标志物代谢通路的研究方法，其特征在于：采用核磁共振技术检测分析链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠及瑶山甜茶干预后的尿液代谢产物，获得代谢指纹图谱，利用多元变量统计分析筛选出九个瑶山甜茶潜在抗糖尿病相关尿液标志物并进行鉴定；利用metaboanalyst在线分析软件筛选出瑶山甜茶抗糖尿病的六个代谢通路网络并进行分析；

获得广西瑶山甜茶降糖的潜在标志物代谢通路的具体实现步骤如下：

(1)广西瑶山甜茶提取液的制备：

称取100g的广西甜茶叶，去除多余的枝干，晒干粉碎，添加10倍量微沸的蒸馏水提取两次，每次2h,过滤，合并滤液，即得广西甜茶总水提取物浓缩液，其浓度为1g生药/ml，放入-

20℃冰箱冻存；

(2)动物模型的制备：

选取200±20g重量的雄性SD大鼠30只，动物在室温为20～24℃、相对湿度为50～70％、人工模拟自然环境条件下昼夜饲养，动物自由摄食饮水，经适应l周后开始实验；随机选取六只健康大鼠作为正常组，其余大鼠造模，在大鼠禁食不禁水12h后，将链脲佐菌素溶于pH 

4.2～4.5的0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，在避光条件下配制成质量浓度为1％的溶液，按链脲佐菌素55mg/kg作单次腹腔注射，正常对照组注射相同体积pH 4.2～4.5的

0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，72h后连续三天尾静脉采血检测血糖，以连续三次测得血糖≥16.7mmol/L为糖尿病大鼠，造模成功的糖尿病大鼠按随机原则分为模型组和广西瑶山甜茶治疗组，每组六只老鼠，广西瑶山甜茶治疗组按3g生药/kg/d灌胃给药，空白对照组和模型组灌胃给予相同体积的0.9％氯化钠溶液，连续六周；

(3)大鼠尿液的保存和前处理：

第六周时利用代谢笼收集各组大鼠的24小时尿液，用浓度为10mg/mL的叠氮化钠

0.01ml保存于2mL的离心管中，每管1.5ml，于－80℃温度下保存，测定前取在室温溶解的尿样，加入pH＝7.4的0.2ml磷酸缓冲液，用混匀器混匀混合液，于室温静置10min，在转速为

14000rpm条件下离心10min，取上清液0.45ml于5mm核磁管，加入含四甲基硅烷0.1mg/mL的

0.05ml重水中，混匀，得到尿液标本；

(4)核磁共振检测：

在室温30℃下，用Varian INOVA 600MHz NMR核磁共振仪检测步骤(3)的尿液标本，采用Carr-Purcell-Meiboom-Gill脉冲序列进行检测，脉冲序列可以压制水峰和大分子物质的信号，从而检测尿液中的小分子代谢物，具体参数设置如下：谱宽8000Hz，采样点64k，采样时间4s，弛豫延迟2s，自旋回波时间320ms，均在弛豫延迟期间采用预饱和照射水峰；

(5)核磁共振1H-NMR图谱数据预处理：

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采用MestReNova核磁图谱专业处理软件对所有核磁共振H-NMR图谱进行相位、基线调整；在核磁共振NMR图谱中,以四甲基硅烷的化学位移δ0ppm为标准进行化学位移校正；以每段0.04ppm为单位，对δ0.01～6.00区域的谱图进行等宽度分割，去除δ4.60～5.60区域水峰，对图谱进行分段积分，将积分数据归一化处理，以txt文本格式保存；

(6)利用多元变量统计分析并筛选潜在生物标志物：

在获得核磁共振数据后，采用SIMCA-P12.0软件对导入的对照组、糖尿病大鼠模型组、瑶山甜茶治疗组三组尿液样本数据进行主成分分析和偏最小方差判别分析；主成分分析作为无监督式学习方法，可以真实反映样本的聚类情况，所建模型变量的拟合能力指数R2Y表示模型的解释率，模型的预测指数Q2cum表示模型的预测率，见表1；在三组尿液样本的主成分分析PCA图中，糖尿病大鼠模型组与空白对照组分离良好，无交叉和重叠，说明两组代谢模式存在明显的差异；瑶山甜茶治疗组介于空白组和糖尿病大鼠模型组之间，与空白组有部分重叠，提示瑶山甜茶治疗后糖尿病大鼠尿液代谢模式出现改变，表明瑶山甜茶对链脲佐菌素诱导的糖尿病模型大鼠的代谢紊乱有一定的干预作用；进一步采用有监督式方法进行建模分析，模型参数见表1，空白对照组、糖尿病大鼠模型组和瑶山甜茶治疗组的偏最小方差分析PLS-DA图中，瑶山甜茶治疗组与空白对照组分离良好，无交叉和重叠；瑶山甜茶治疗组介于与空白组和糖尿病模型组之间，与空白组部分重叠，提示瑶山甜茶治疗后糖尿病大鼠尿液代谢模式出现改变，更趋向正常，表明瑶山甜茶有一定的抗糖尿病作用；对三组尿液样本核磁共振数据进行偏最小方差分析PLS-DA，得到空白对照组和糖尿病大鼠模型组的偏最小方差分析PLS-DA载荷图，图中“S”曲线中每一个点代表1个变量，变量对分类的重要程度由相关系数的大小来衡量，变量越远离原点，相关系数值越大，对代谢物发生变化的贡献也越大，为了找到使其存在差异的潜在的生物标记物，选取S-plot上“-0.1-0.1”以外的变量作为有差异的潜在生物标记物，能够突显出空白组和糖尿病模型组差异的最大化合物，可被认为是与糖尿病代谢相关的潜在标志物，潜在生物标记物的化学位移为：3.24、

3.28、3.4、3.44、3.48、3.52、3.56、3.72、3.76、3.8、3.88、3.92、4.68、5.24；

表1 评价模型质量参数

(7)潜在生物标记物的鉴定及其含量变化：

查阅已有的归属文献，同时搜索http://hmdb.ca/数据库，对找到的潜在生物标记物的化学位移进行鉴定，用SPSS软件对这些代谢物的峰面积进行独立样本t检验，得到与对照组比较具有显著差异的九个潜在生物标志物：牛磺酸、脯氨酸、胆碱、甘氨酸、亮氨酸、甘油、甜菜碱、肌酸和葡萄糖，这九个标志物含量在糖尿病大鼠模型组中均增高，经瑶山甜茶治疗后含量降低，在MetaboAnalyst上对鉴定的潜在生物标记物进行代谢通路在线查询，有六个相关代谢通路参与了瑶山甜茶抗高血糖的代谢过程，如表2所示；

表2 潜在生物标志物的鉴定和在空白对照组、糖尿病大鼠模型组和甜茶治疗组中的含量变化

*P<0.05**P<0.01***P<0.001

(8)潜在生物标记物的分析：

进一步利用MetaboAnalyst对鉴定的潜在生物标记物进行代谢通路重要性分析，通过代谢通路分析后所得影响值大小，依据代谢通路的p值和通路重要值，牛磺酸代谢通路，缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸代谢通路，甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸代谢通路，甘油代谢通路四个代谢通路为瑶山甜茶抗糖尿病的重要代谢通路，参与了瑶山甜茶抗糖尿病的主要代谢过程，形成相互交错的代谢网络，完整的阐释了瑶山甜茶抗糖尿病的作用机制。