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专利号: 2018102650002
申请人: 华南农业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 测量;测试
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种鸡传染性支气管炎ELISA抗体检测试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒含有IBV非结构蛋白5b包被的ELISA反应板。

2.根据权利要求1所述试剂盒,其特征在于,所述的IBV非结构蛋白5b其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示;其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

3.根据权利要求1所述试剂盒,其特征在于,所述的IBV非结构蛋白5b是通过重组表达产生的。

4.根据权利要求3所述试剂盒,其特征在于,IBV非结构蛋白5b重组表达的方法如下:S1.RT-PCR扩增IBV 5b基因;

S2.将步骤S1所得基因整合到质粒载体中,获得重组质粒;

S3.将步骤S2所构建的重组质粒转化到宿主菌中并诱导表达,获得菌液;

S4.筛选携带IBV 5b基因的重组菌,在IPTG诱导下大量表达与HIS融合的5b重组蛋白;

S5.利用HIS标签镍柱亲和层析柱纯化,获得提纯后的IBV 5b重组蛋白。

5.根据权利要求4所述试剂盒,其特征在于,步骤S1中,扩增IBV 5b基因的引物对如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示;

步骤S2中,所述的质粒载体为pET-32a;

步骤S3中,所述的宿主菌为大肠杆菌。

6.根据权利要求1所述试剂盒,其特征在于,还包括:(1)酶标试剂;

(2)封闭液;

(3)洗涤液;

(4)稀释液;

(5)阳性对照样品;

(6)阴性对照样品;

(7)显色液;

(8)终止液。

7.根据权利要求6所述试剂盒,其特征在于,所述的酶标试剂为辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgG抗体;

所述的洗涤液为含0.01%~0.1%Tween-20的PBS;优选地,为含0.05%Tween-20的PBS;

所述的封闭液为含BSA或脱脂奶粉的PBS;优选地,为含5%脱脂奶粉的PBS;

所述的稀释液为含BSA、脱脂奶粉的PBST;优选地,为含5%脱脂奶粉的PBST;

所述的阳性对照样品为抗IBV 5b鸡血清;

所述的阴性对照样品阴性SPF鸡血清;

所述的显色液为TMB单组分显色液;

所述的终止液为1M~2M H2SO4;优选地,为2M H2SO4。

8.根据权利要求7所述试剂盒,其特征在于,所述试剂盒的使用方法为:

1)抗原包被;

2)封闭;

3)一抗孵育;

4)二抗孵育;

5)显色;

6)终止;

7)结果判定。

9.根据权利要求8所述的试剂盒,其特征在于,步骤(1)中,抗原包被的浓度为2~10μg/mL,抗原包被为4℃过夜;优选地,抗原包被的浓度为5μg/mL;更优选地,包被液为pH为9.6的0.05M碳酸盐缓冲液;

优选地,步骤(2)中,封闭液为含脱脂奶粉或BSA的PBS,封闭时间为1~3h;更优选地,封闭液为含0.2%BSA、5%或7.5%脱脂奶粉的PBS,封闭时间为2h;还更优选地,封闭液为含

5%的脱脂奶粉的PBS;

优选地,步骤(3)中,待检血清的稀释浓度为1:200~1:600,一抗在35~39℃孵育45min~90min;更优选地,血清的稀释浓度为1:400;一抗在37℃孵育60min;

优选地,步骤(4)中,酶标二抗稀释倍数为1:5000~1:10000,二抗在35~39℃孵育30~

90min;更优选地,酶标二抗稀释倍数为1:10000,二抗在37℃孵育45min;

优选地,步骤(5)中,显色剂为TMB,在室温避光显色8min~15min;更优选显色10min;

优选地,步骤(6)中,终止采用的终止液为1M~2M H2SO4;更优选地,为2M H2SO4;

优选地,步骤(7)中,采用酶标仪测OD450nm处吸光值判定标准为:对样品OD450nm值≥

0.336时判定为IBV阳性,反之则为阴性。

10.权利要求1-9任一所述试剂盒,其特征在于,应用于检测传染性支气管炎灭活疫苗免疫鸡和鸡感染传染性支气管炎病毒后诱导产生的传染性支气管炎病毒特异性抗体。