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专利号: 2018102689318
申请人: 苏州至汇生物科技有限公司
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 有机化学〔2〕
更新日期:2024-11-18
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种基于亲和层析的水蛭素分离纯化方法,其特征在于,包括以下步骤:

1)水蛭素粗提取:用生理盐水喂饱水蛭活体后,物理挤压使其分泌唾液并收集,将获得的水蛭唾液样本,浸提,离心,取沉淀,备用;

2)分离纯化:将步骤1)所述沉淀加入蒸馏水,充分溶解,调节pH 6.0-8.0,用凝血酶Sepharose 4FF亲合柱进行分离纯化,高效液相色谱检测水蛭素含量,取水蛭素含量峰值处纯化液,备用;

3)脱盐浓缩:将上述纯化液进行透析,并且过程中重复加水2-4次,持续10-15h,将超滤后的上清液进行旋转蒸发,去除水分70-80 %后,取浓缩液备用;

4)取浓缩液冻干机冻干,得水蛭素产品。

2.如权利要求1所述的一种基于亲和层析的水蛭素分离纯化方法,其特征在于,步骤1)中采用HCL调节pH至3.0-5.0,使部分杂质蛋白失活,且不影响目的产物的活性。

3.如权利要求1所述的一种基于亲和层析的水蛭素分离纯化方法,其特征在于,步骤1)浸提步骤为:加入预冷三氯乙酸提取液混匀,浸提,离心取上清,调节 pH3.0-5.0后加入预冷的丙酮混匀静置过夜,回收上清中丙酮,离心,取沉淀。

4.如权利要求1所述的一种基于亲和层析的水蛭素分离纯化方法,其特征在于,步骤2)凝血酶Sepharose 4FF亲合柱中载体活化剂为羰基二咪唑。

5.如权利要求1所述的一种基于亲和层析的水蛭素分离纯化方法,其特征在于,步骤2)的装柱方法为:取1/2-3/4倍柱体积的凝血酶Sepharose 4FF介质装于分离柱内,用15倍柱床体积的PH 7.4-8.4的磷酸盐缓冲液以3-5mL/min流速冲洗柱床,洗涤至平衡。

6.如权利要求1所述的一种基于亲和层析的水蛭素分离纯化方法,其特征在于,步骤2)的洗脱液为(0.01-0.03 )mol/L KCL—(0.1-0.3 )mol/L HCL,洗脱速度为每管1 ml/3 min。

7.如权利要求2所述的一种基于亲和层析的水蛭素分离纯化方法,其特征在于,步骤(2)中高效液相色谱检测条件:色谱柱:C18 10×200mm、检测器:UV 210nm、流动相:甲醇:水=3:1、柱温:25℃、进样量:10μL 、流速:1mL/min。

8.如权利要求1所述的一种基于亲和层析的水蛭素分离纯化方法,其特征在于,步骤3)所述透析采用的透析膜为截留分子量小于等于7000的透析袋。