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专利号: 2018102918849
申请人: 山东师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-11-13
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种检测碱性磷酸酶的试剂盒,其特征在于:包括与碱性磷酸酶反应的双链DNA底物、Taqman探针、引发Taqman探针的循环切割的双链特异性核酸酶;所述双链DNA底物由5'-磷酸化的T7启动子单链和模板双链体结合得到;

优选的,所述试剂盒还包括双链特异性核酸酶缓冲液,所述缓冲液的组成为:50mmol/L的pH 8.0的Tris-HCl,5mmol/L的氯化镁,1mmol/L的二硫苏糖醇;

进一步优选的,Tris-HCl、氯化镁、二硫苏糖醇的体积比为48-52:3-6:0.6-1.4;

优选的,所述试剂盒还包括5'-磷酸化的T7启动子单链和模板双链体结合所用的Tris-EDTA缓冲液和退火缓冲液;所述退火缓冲液为5mmol/L的pH 8.0的Tris-HCl和50mmol/L的氯化钠;

进一步优选的,退火缓冲液中Tris-HCl和氯化钠的体积比为0.3-0.7:3-7。

2.根据权利要求1所述的检测碱性磷酸酶的试剂盒,其特征在于:所述磷酸化的T7启动子序列为5’-磷酸-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3’;

所述模板序列为5’-TAA CAC TGT CTG GTA AAG ATG GCC CTA TAG TGA GTC GTATTA-

3’;

所述Taqman探针序列为5’-FAM-TAA CAC TGT CTG GTA AAG ATG G-Eclipse-3’;所述Taqman探针在5'末端用FAM荧光标记,在其3'末端用Eclipse标记。

3.一种检测碱性磷酸酶的方法,其特征在于:所述方法使用权利要求1所述试剂盒,具体步骤为:

1)5'-磷酸化的T7启动子的去磷酸化

将碱性磷酸酶和100nmol/L的双链DNA底物,Cut Smart缓冲液混合,孵育后灭活得到混合溶液A;然后,将1单位的λ核酸外切酶加入到以上混合溶液A中得到混合溶液B,混合溶液B进行先孵育之后,再进行后孵育将λ核酸外切酶灭活,得到混合溶液C;

2)转录反应

取一定体积D的步骤1)中得到的混合溶液C,其中含有一定量的λ核酸外切酶消化产物,在RNA生产系统中反应,得到转录产物溶液E;

3)互补配对

取一定体积F的步骤2)得到的转录产物溶液E、双链特异性核酸酶缓冲液、20个单位的RNA酶抑制剂和600nmol/L的Taqman探针在一定体积的溶液G中反应;

4)荧光检测

荧光光谱用装备有氙灯作为激发光源的荧光分光光度计进行测量,用490纳米的激发波长,在500-650纳米的范围内记录荧光光谱,激发和发射狭缝分别设定为5.0和5.0纳米;

优选的,步骤1)中得到混合溶液A前孵育的温度为30-40℃;孵育的时间为20-40分钟;

优选的,步骤1)中得到混合溶液A前灭活的温度为60-70℃;灭活的时间为3-7分钟;

优选的,步骤1)中混合溶液B先孵育的温度为30-40℃;孵育的时间为20-40分钟;

优选的,步骤1)中混合溶液B后孵育的温度为80-100℃;孵育的时间3-7分钟;

优选的,步骤2)中反应温度为30-40℃;反应时间为50-70分钟;

优选的,步骤1)中的Cut Smart缓冲液的组成为:50mmol/L的醋酸钾,20mmol/L的pH 

7.9的Tris-Ac,10mmol/L的醋酸镁,100ug/L的牛血清白蛋白;

优选的,醋酸钾、Tris-Ac、醋酸镁和牛血清白蛋白的体积比为5:2:1:1。

4.根据权利要求3所述的检测碱性磷酸酶的方法,其特征在于:步骤1)中混合溶液A、步骤2)中的体积含量D、步骤3)中的体积含量F、步骤3)中的溶液G的体积比为3-5:5-7:0.8-

1.2:5-7。

5.根据权利要求3所述的检测碱性磷酸酶的方法,其特征在于:步骤1)中的双链DNA底物与Cut Smart缓冲液的体积比为0.8-1.2:1-3。

6.根据权利要求3所述的检测碱性磷酸酶的方法,其特征在于:步骤2)中混合溶液C与λ核酸外切酶消化产物的体积比为4-6:0.8-1.2。

7.根据权利要求3所述的检测碱性磷酸酶的方法,其特征在于:步骤3)中体积F、双链特异性核酸酶缓冲液和Taqman探针的体积比为0.8-1.2:1-3:1-2。

8.根据权利要求3所述的检测碱性磷酸酶的方法,其特征在于:步骤3)中反应温度为

50-60℃;反应时间为30-50分钟。

9.根据权利要求3所述的检测碱性磷酸酶的方法,其特征在于:双链DNA底物储备溶液的制备方法,具体步骤为:将寡核苷酸用10×Tris-EDTA缓冲液稀释制备储备溶液,1微摩尔每升的T7启动子链与

1微摩尔每升的模板链在退火缓冲液中孵育,随后缓慢冷却至室温,形成的双链DNA底物储存在3-5℃使用;

优选的,在退火缓冲液中孵育的温度为90-100℃;孵育的时间为3-7分钟。

10.一种检测碱性磷酸酶的试剂盒及其方法在复杂生物样品中的靶标抑制剂的筛选以及癌细胞中靶标的定量检测;所述癌细胞为宫颈癌细胞。