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专利号: 2018103006099
申请人: 山东师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2025-04-15
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种基于FRET的纳米荧光化学传感器,其特征在于,所述传感器包括miR-21和miR-

221的环形模板、Bst DNA聚合酶、dNTPs、用于HRCA反应的反向引物、捕获探针、链霉亲和素包裹的硒化镉/硫化锌核/壳量子点的525QD、Cy3和Texas Red标记的报告探针。

2.如权利要求1所述的传感器,其特征在于,所述适用于miR-21的环模板碱基序列为:

5′-CAG AAC AGC ACA AGA CAG GAC AAG ACA CAC GCC GAA TCA ACA TCA GTC TGA TAA GCT ACC AGA CAG ACG A-3′;

所述适用于miR-221的环模板碱基序列为:5′-CAG AAC AGC ACA AGA CAG GAC AAG ACA CAC GCC GAA GAA ACC CAG CAG ACA ATG TAG CTC CAG ACA GAC GA-3′;

所述用于HRCA反应的反向引物碱基序列为:5′-GAC AGA CGA CAG AAC AG-3′;

所述捕获探针碱基序列为:5′-biotin-GGC GTG TGT CTT GTC CTG-3′;

Cy3标记的报告探针碱基序列为:5′-TAG CTT ATC AGA CTG ATG TTG A-Cy3-3′;

Texas Red标记的报告探针碱基序列为:5′-AGC TAC ATT GTC TGC TGG GTT TC-Texas Red-3′。

3.如权利要求1所述的传感器,其特征在于,Cy3用于指示miR-21的存在,Texas Red用于指示miR-221的存在。

4.权利要求1-3所述的纳米荧光化学传感器在癌症检测试剂盒中的应用。

5.一种同时检测细胞中miR-21和miR-221的检测方法,通过HRCA反应将细胞中miR-21和miR-221的信号放大,HRCA产物与捕获探针及报告探针发生杂化反应,通过链霉素亲和素-生物素的作用,形成QD-DNA-受体纳米结构,从而使QD和受体之间产生有效FRET,通过荧光光谱仪测量荧光强度从而确定细胞中miR-21和miR-221的含量,其特征在于,miR-21和miR-221的HRCA反应在同一反向引物的作用下发生,HRCA产物能特异性的与相同的捕获探针结合。

6.如权利要求5所述的检测方法,其特征在于,所述捕获探针的碱基序列为:5′-biotin-GGC GTG TGT CTT GTC CTG-3′。

7.如权利要求5所述的检测方法,其特征在于,所述HRCA反应步骤为:10纳摩尔每升miR-21环模板和10纳摩尔每升miR-221环模板混合物;100纳摩尔每升反向引物,适当浓度目标RNA在含有20毫摩尔每升Tris-HCl,10毫摩尔每升氯化钾,10毫摩尔每升硫酸胺,2毫摩尔每升硫酸镁,0.1%吐温-100,pH为8.8的缓冲液中,95℃加热5分钟,随后缓慢冷却至室温;随后加入8单位Bst DNA聚合酶,200微摩尔每升dNTPs和16单位RNA酶抑制剂至总体积为

20微升。上述溶液在60℃反应一小时,随后在80℃反应20分钟终止反应。

8.如权利要求5所述的检测方法,其特征在于,所述杂化反应具体步骤为:20微升HRCA反应产物,0.3微升20微摩尔每升的Cy3和/或Texas Red标记的报告探针和0.3微升20微摩尔每升的生物素化的捕获探针加入到含有100毫摩尔每升Tris-HCl,10毫摩尔每升硫酸胺,

3毫摩尔每升氯化镁,pH为8.0的缓冲液中,至终体积为78微升;上述混合物在95℃反应五分钟,后在45℃反应1小时,随后冷却至室温;向上述混合物加入2微升0.2微摩尔每升的链霉亲和素包裹的525QD致终体积80微升;在室温下反应15分钟。

9.如权利要求5所述的检测方法,其特征在于,所述荧光检测中,FRET效率根据公式E=

1-FDA/FD计算,FD为受体不存在时的QD荧光强度,FDA为受体存在时的QD荧光强度。

10.权利要求4所述癌症检测试剂盒在权利要求5所述的检测方法中的应用,所述癌症包括乳腺癌,卵巢癌,子宫癌,结肠癌,肺癌,肝癌,脑癌,食道癌,前列腺癌,恶性胶质瘤,以及胰腺癌甲状腺癌。