1.一种采用DNA及PCR技术鉴定新鲜羊肉贮藏时间的方法,其特征在于该方法由以下步骤组成:
(1)分离提取贮藏的羊肉样品中羊DNA,并对DNA含量进行检测;
(2)以提取的羊DNA为模板,采用羊线粒体基因16S rRNA和内参基因β‑globin2的引物分别进行荧光定量PCR扩增,获得羊线粒体基因与内参基因扩增产物的ct值,计算Δct值,Δct值的计算公式为:Δct=∣ct羊线粒体基因‑ct内参基因∣;
所述羊内参基因的引物序列如下:
上游引物:5’‑CGGCGGCGGGCGGCGCGGGCTGGGCGGGAAGGCCCATGGCAAGAAGG‑3’;
下游引物:5’‑GCCGGCCCGCCGCGCCCGTCCCGCCGCTCACRCAGCGCAGCAAAGG‑3’;
所述羊线粒体基因16S rRNA的引物序列如下:上游引物:5’‑GGTTCGTTTGTTCAACGATTAA‑3’;
下游引物:5’‑AGATAGAAACCGACCTGGATT‑3’;
(3)4℃温度下贮藏5天以内的羊肉样品,若DNA含量大于800μg/g,说明羊肉样品是一级鲜肉;若DNA含量在800μg/g以下,说明羊肉样品是一级鲜肉或二级鲜肉,将羊肉样品继续贮藏1天,若DNA含量增加说明羊肉样品是二级鲜肉,若DNA含量减小说明羊肉样品是一级鲜肉;若羊肉样品为一级鲜肉,贮藏时间与Δct值拟合的数学方程为Y2 = 1.5351X ‑16.027,2
其中Y2代表贮藏天数,R = 0.9901;若羊肉样品为二级鲜肉,贮藏时间与Δct值拟合的数学2
方程为Y2 = ‑1.3242X+17.394,R=0.9891。
2.根据权利要求1所述的采用DNA及PCR技术鉴定新鲜羊肉贮藏时间的方法,其特征在于分离提取贮藏的羊肉样品中羊DNA的方法为:(1)称取0.3g羊肉糜于2mL离心管中,加入550μL DNA提取缓冲液、150μL 5% SDS裂解液及18μL 20mg/mL的蛋白酶K水溶液,于55℃下水浴消化4小时,然后加入700μL苯酚,摇晃
10min,于12000r/min下离心10min;
(2)取上清液置于新离心管中,加入400μL苯酚与氯仿、异戊醇体积比为25:24:1的混合液,摇晃10min,于12000r/min下离心10min,再将上清液置于新离心管中,加入400μL氯仿与异戊醇体积比为24:1的混合液,摇晃10min,于12000r/min下离心10min;
(3)重复步骤(2)一次,取上清液置于新离心管中,加入800μL的冰无水乙醇,反复摇匀后,置于冰箱中‑18℃静置30min,静置后于12000r/min下离心10min,弃去上层清液,加入体积分数为75%的冰乙醇水溶液,用枪头反复吹打离心管中的溶液,然后于12000r/min下离心
10min,弃去上层清液在通风橱内风干30min后,加入50μL TE溶解DNA,置于冷藏冰箱中,‑20℃保存备用。
3.根据权利要求1所述的采用DNA及PCR技术鉴定新鲜羊肉贮藏时间的方法,其特征在于所述荧光定量PCR扩增的反应体系为:DNA 1μL,2×Ultal SYBR Mixture 5μL,上、下游引物各0.3μL,ddH2O 3.4μL。
4.根据权利要求1所述的采用DNA及PCR技术鉴定新鲜羊肉贮藏时间的方法,其特征在于所述荧光定量PCR扩增的反应程序为:95℃变性10min,以95℃ 15s、63℃ 30s、72℃ 30s扩增40个循环。