1.一种采用DNA及PCR技术鉴定新鲜牛肉贮藏时间的方法，其特征在于该方法由以下步骤组成：

(1)分离提取贮藏的牛肉样品中牛DNA，并对DNA含量进行检测；

(2)以提取的牛DNA为模板，对牛线粒体基因12S rRNA和内参基因β-globin2的引物分别进行荧光定量PCR扩增，获得牛线粒体基因与内参基因扩增产物的ct值，计算Δct值，Δct值的计算公式为：Δct＝∣ct牛线粒体基因-ct内参基因∣；

(3)-20℃贮藏温度下，若DNA含量大于950μg/g，说明牛肉样品是一级鲜肉；若DNA含量在950μg/g以下，说明牛肉样品是一级鲜肉、二级鲜肉或变质肉，将牛肉样品继续贮藏1天，若DNA含量增加说明牛肉样品是二级鲜肉，若DNA含量减小说明牛肉样品是一级鲜肉或变质肉，变质肉通过气味和颜色区分；牛肉样品为一级鲜肉时，贮藏时间与Δct值拟合的数学方程为Y1＝0.8489X-8.0306，其中Y1代表贮藏月数，X代表Δct值，R2＝0.9142；牛肉样品为二2

级鲜肉时，贮藏时间与Δct值拟合的数学方程为Y1＝-14.185X+172.63，R＝0.9506；

4℃贮藏温度下，若DNA含量大于750μg/g，说明牛肉样品是一级鲜肉；若DNA含量在750μg/g以下，说明牛肉样品是一级鲜肉、二级鲜肉或变质肉，将牛肉样品继续贮藏1天，若DNA含量增加说明牛肉样品是二级鲜肉，若DNA含量减小说明牛肉样品是一级鲜肉或变质肉，变质肉通过气味和颜色区分；若牛肉样品为一级鲜肉，贮藏时间与Δct值拟合的数学方程为Y2＝0.793X-7.3563，其中Y2代表贮藏天数，R2＝0.9899；若牛肉样品为二级鲜肉，贮藏时间与Δct值拟合的数学方程为Y2＝-1.3227X+17.656，R2＝0.9607；

10℃贮藏温度下，若DNA含量大于1000μg/g，说明牛肉样品是一级鲜肉；若DNA含量在

1000μg/g以下，说明牛肉样品是一级鲜肉、二级鲜肉或变质肉，将牛肉样品继续贮藏1天，若DNA含量增加说明牛肉样品是二级鲜肉，若DNA含量减小说明牛肉样品是一级鲜肉或变质肉，变质肉通过气味和颜色区分；若牛肉样品为一级鲜肉，贮藏时间与Δct值拟合的数学方程为Y3＝7.2691X-67.887，其中Y3代表贮藏小时数，R2＝0.9046；若牛肉样品为二级鲜肉，贮藏时间与Δct值拟合的数学方程为Y3＝-13.603X+189.77，R2＝0.9779；

20℃贮藏温度下，若DNA含量大于850μg/g，说明牛肉样品是一级鲜肉；若DNA含量在850μg/g以下，说明牛肉样品是一级鲜肉、二级鲜肉或变质肉，将牛肉样品继续贮藏1天，若DNA含量增加说明牛肉样品是二级鲜肉，若DNA含量减小说明牛肉样品是一级鲜肉或变质肉，变质肉通过气味和颜色区分；若牛肉样品为一级鲜肉，贮藏时间与Δct值拟合的数学方程为Y3＝3.6923x-34.031，R2＝1；若牛肉样品为二级鲜肉，贮藏时间与Δct值拟合的数学方程为Y3＝-9.1462x+114.2，R2＝0.907。

2.根据权利要求1所述的采用DNA及PCR技术鉴定新鲜牛肉贮藏时间的方法，其特征在于分离提取贮藏的牛肉样品中牛DNA的方法为：(1)称取0.3g牛肉糜于2mL离心管中，加入550μL DNA提取缓冲液、150μL5％SDS裂解液及18μL 20mg/mL的蛋白酶K水溶液，于55℃下水浴消化4小时，然后加入700μL苯酚，摇晃

10min，于12000r/min下离心10min；

(2)取上清液置于新离心管中，加入400μL苯酚与氯仿、异戊醇体积比为25:24:1的混合液，摇晃10min，于12000r/min下离心10min，再将上清液置于新离心管中，加入400μL氯仿与异戊醇体积比为24:1的混合液，摇晃10min，于12000r/min下离心10min；

(3)重复步骤(2)一次，取上清液置于新离心管中，加入800μL的冰无水乙醇，反复摇匀后，置于冰箱中-18℃静置30min，静置后于12000r/min下离心10min，弃去上层清液，加入体积分数为75％的冰乙醇水溶液，用枪头反复吹打离心管中的溶液，然后于12000r/min下离心10min，弃去上层清液在通风橱内风干30min后，加入50μL TE溶解DNA，置于冷藏冰箱中，-

20℃保存备用。

3.根据权利要求1所述的采用DNA及PCR技术鉴定新鲜牛肉贮藏时间的方法，其特征在于所述牛内参基因的引物序列如下：上游引物：5’-CGGCGGCGGGCGGCGCGGGCTGGGCGGGAAGGCCCATGGCAAGAAGG-3’；

下游引物：5’-GCCGGCCCGCCGCGCCCGTCCCGCCGCTCACRCAGCGCAGCAAAGG-3’。

4.根据权利要求1所述的采用DNA及PCR技术鉴定新鲜牛肉贮藏时间的方法，其特征在于所述牛线粒体基因12S rRNA的引物序列如下：上游引物为5’-CCCATTTCACCCTTACTACACCA-3’；

下游引物为5’-ATTGA GTGGATTTGCTGGGATA-3’。

5.根据权利要求1所述的采用DNA及PCR技术鉴定新鲜牛肉贮藏时间的方法，其特征在于所述荧光定量PCR扩增的反应体系为：DNA 1μL，2×2×Ultal SYBR Mixture 5μL，上、下游引物各0.3μL，ddH2O 3.4μL。

6.根据权利要求1所述的采用DNA及PCR技术鉴定新鲜牛肉贮藏时间的方法，其特征在于所述荧光定量PCR扩增的反应程序为：95℃变性10min，以95℃15s、63℃30s、72℃30s扩增

40个循环。