1.一种D,D-羧肽酶DacA突变体,其特征在于,以SEQ ID NO.1所示氨基酸序列为出发序列,将第113位赖氨酸残基替换为精氨酸、甘氨酸或组氨酸。
2.编码权利要求1所述D,D-羧肽酶DacA突变体的基因。
3.携带权利要求2所述基因的载体。
4.携带权利要求2所述基因或表达权利要求1所述D,D-羧肽酶DacA突变体的基因工程菌或转基因细胞系。
5.制备权利要求1所述D,D-羧肽酶突变体的方法,其特征在于,以大肠杆菌(Escherichia coli)为表达宿主,通过定点突变或置换方法在D,D-羧肽酶DacA催化结构域内关键氨基酸进行氨基酸替换,获得了催化效率提高的D,D-羧肽酶DacA突变体。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,具体步骤如下:
1)根据SEQ ID NO.2所示的E.coli D,D-羧肽酶的基因序列,以E.coli BL21基因组为模板采用PCR方法将编码D,D-羧肽酶的基因克隆到质粒pET-28a(+)中,构建重组质粒pET28a-dacA;
2)设计突变引物,对编码D,D-羧肽酶DacA的基因序列进行定点突变,将所述位点的氨基酸进行替换,获得含有编码突变D,D-羧肽酶DacA的基因序列的重组载体;
5)将突变后重组载体转化E.coli BL21,诱导表达,获得D,D-羧肽酶DacA突变体。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述诱导表达是:将重组E.coli BL21在LB培养基中37℃培养8h,然后按1%(v/v)的接种量接种到TB培养基中,37℃培养至OD600=
0.8,加入终浓度为1mmol/L异丙基-β-d-硫代半乳糖苷,25℃诱导表达。
8.权利要求1所述D,D-羧肽酶DacA在代谢改造微生物提高其胞外蛋白分泌表达水平方面的应用。
9.权利要求1所述D,D-羧肽酶DacA在催化Park核苷酸生成D-丙氨酸中的应用。