1.一种检测组蛋白乙酰转移酶的电化学发光法拉第笼免疫传感器,其特征在于该电化学发光免疫传感器通过以下方法构建的:
首先,制备捕获单元:合成磁性氧化石墨烯nanoFe3O4@GO,依次用EDC/NHS溶液、HCl处理,随后与捕获抗体Ab1结合,混合均匀,常温孵育,最后加入BSA封闭GO表面的非特异性结合位点获得捕获单元Ab1-nanoFe3O4@GO。其次,制备信号单元:识别抗体Ab2连接DNA四面体中,合成四面体-Ab2;再合成纳米金(AuNPs),使之与氧化石墨烯形成复合物GO@AuNPs,随后与四面体-Ab2结合,再加入Ru发光体,制得信号单元。最后,制备法拉第笼免疫传感器:取Ab1-nanoFe3O4@GO滴涂于MGCE表面,得Ab1-nanoFe3O4@GO/MGCE,记为电极a;取p300溶液滴涂于Ab1-nanoFe3O4@GO/MGCE,得p300/Ab1-nanoFe3O4@GO/MGCE,记为电极b;再取Ru-GO@AuNPs-四面体-Ab2溶液滴涂于p300/Ab1-nanoFe3O4@GO/MGCE,得Ru-GO@AuNPs-四面体-Ab2/p300/Ab1-nanoFe3O4@GO/MGCE,记为电极c,即为电化学发光法拉第笼免疫传感器。
2.如权利要求1所述的电化学发光法拉第笼免疫传感器,其特征是,制备氧化石墨烯nanoFe3O4@GO的具体方法是:取20~60mg氧化石墨烯(GO)于20~60mL二次水中,超声15~
45min后,加入25~75mL上述铁离子混合溶液,快速搅拌,将上述混合溶液温度升至75~95℃,在快速搅拌回流状态下,逐滴加入20~30%氨水(NH4OH)至溶液pH为10,并反应30~
60min,溶液颜色由棕色变为黑色,冷却至室温后,利用所得混合物的磁性,二次水反复清洗,直至上清液pH为中性,得到nanoFe3O4@GO溶液,用PBS(0.1M,pH7.4)定容至10~30mL,得浓度2mg/mL nanoFe3O4@GO的分散液。
3.如权利要求1、2所述的电化学发光法拉第笼免疫传感器,其特征是,合成捕获单元(Ab1-nanoFe3O4@GO)的具体方法是:取25~75μL合成的nanoFe3O4@GO于200μL离心管中,加入
25~75μL新制备的(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)溶液(100μM/10μM),混合均匀后,滴加0.1M HCl至上述溶液pH为5.0;常温孵育
0.5~1.5h,使GO表面形成稳定的活性酯层;基于磁性,用水快速洗涤直至上清液为中性;然后加入25~75μL 0.5×10-3~1.5×10-3mg/mL组蛋白乙酰转移酶第一抗体(Ab1)溶液,混合均匀,常温孵育2~6h;最后加入25~75μL 2wt%牛血清蛋白(BSA),孵育0.5~1.5h,目的是封闭GO表面的非特异性结合位点;利用磁性,水洗三次,即可获得捕获单元Ab1-nanoFe3O4@GO。
4.如权利要求1所述的电化学发光法拉第笼免疫传感器,其特征是,合成纳米金(AuNPs)的具体方法是:将氯金酸(HAuCl4)(0.005~0.015M,0.125~0.375mL),十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)(0.05~0.15M,0.5~1.5mL)与水(7.05~10.05mL)混合,向反应混合物中加入抗坏血酸(0.05~0.15M,0.5~1.5mL),然后加入氢氧化钠(0.05~0.15M,0.5~
1.5mL)。将溶液震荡1~3min,静置1~3h。然后得到CTAB包覆的AuNPs,7000rpm离心10min,纯化后分散在10mL超纯水中。
5.如权利要求1、4所述的电化学发光法拉第笼免疫传感器,其特征是,合成纳米金/氧化石墨烯复合材料(GO@AuNPs)的具体方法是:取2~6mg GO加入到0.5~1.5mL上述AuNPs溶液中,超声分散0.5~1.5h,得GO@AuNPs,随后静置15~45min备用。
6.如权利要求1所述的电化学发光法拉第笼免疫传感器,其特征是,合成DNA四面体-第二抗体(DNA四面体-Ab2)的具体方法是:取修饰-NH2的DNA-A链(0.25~0.75μL,10~30μM),加入组蛋白乙酰转移酶第二抗体溶液(Ab2)(0.5~1.5μL,0.5×10-2~1.5×10-2mg/mL),同时加入pH为6.0的EDC/NHS偶联试剂(0.5~1.5μL,100μM/10μM),室温下震摇1h,再超滤3次,得到纯度较高的DNA-A链-Ab2复合物。另将DNA-B链(0.25~0.75μL,10~30μM)、DNA-C链(0.25~0.75μL,10~30μM)、DNA-D链(0.25~0.75μL,10~30μM)、Tris缓冲液(2.5~7.5μL,溶液组成:20mM Tris,50mM MgCl2,pH8.0)和三(2-羧乙基)膦(TCEP)(0.5~1.5μL,15~
45mM)加入到上述DNA-A链-Ab2复合物溶液中,控制总体积为10μL,在90~100℃下,反应2.5~7.5min,然后4℃迅速降温1min。
7.如权利要求1、4~6所述的电化学发光法拉第笼免疫传感器,其特征是,合成信号单元(Ru-GO@AuNPs-四面体-Ab2)具体方法是:取2.5~7.5μL GO@AuNPs,加入5~15μL四面体-Ab2溶液,震荡1~3min混合均匀,静置过夜,再加入2~6μL浓度为0.5~1.5mg/mL的Ru(phen)3Cl2·H2O溶液混合均匀15~45min,4℃冰箱储存备用。
8.如权利要求1~7所述的电化学发光法拉第笼免疫传感器,其特征是,制备法拉第笼免疫传感器的具体方法是:取Ab1-nanoFe3O4@GO混合液2.5~7.5μL,滴涂于磁性玻碳电极(MGCE)表面,静置0.5~1.5min,得Ab1-nanoFe3O4@GO/MGCE,记为电极a;再取p300溶液2.5~
7.5μL滴涂于Ab1-nanoFe3O4@GO/MGCE表面,37℃下孵育15~45min,得p300/Ab1-nanoFe3O4@GO/MGCE,记为b;最后,取Ru-GO@AuNPs-四面体-Ab22.5~7.5μL滴涂于p300/Ab1-nanoFe3O4@GO/MGCE,37℃静置15~45min得Ru-GO@AuNPs-四面体-Ab2/p300/Ab1-nanoFe3O4@GO/MGCE,记为c,即为所需的电化学发光免疫传感器。
9.如权利要求1~8所述的电化学发光法拉第笼免疫传感器,其特征是,所述的电化学反应的条件如下:电位阶跃计时电流法,脉冲宽度:0.25s;脉冲间隔:30s;初始电压:-1.5V;
脉冲电压:-1.5V。
10.如权利要求1~9所述的电化学发光法拉第笼免疫传感器,其特征是,本发明是基于组蛋白乙酰转移酶p300抗体与p300之间的特异性识别与结合而构建的电化学发光免疫传感器,因此待测液中的干扰物质并不能与抗体结合,对本检测体系无干扰。