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专利号: 2018103389607
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-12-11
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种化学-酶法生产草铵膦的方法,其特征在于所述方法为:以外消旋N-乙酰草铵膦为底物,以含羧肽酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体超声破碎后提取的纯酶为催化剂,以pH值为5~10的缓冲液为反应介质,在45℃水浴摇床200rpm条件下反应,反应完全后,获得含D-N-乙酰草铵膦和L-草铵膦的反应液,将反应液分离纯化,收集D-N-乙酰草铵膦消旋化后用于循环拆分,同时获得L-草铵膦。

2.如权利要求1所述化学-酶法生产草铵膦的方法,其特征在于所述羧肽酶基因核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求1所述化学-酶法生产草铵膦的方法,其特征在于所述底物终浓度以缓冲液体积计为10~100mM,所述催化剂用量以湿菌体重量计为5~50g/L缓冲液。

4.如权利要求1所述化学-酶法生产草铵膦的方法,其特征在于所述外消旋N-乙酰草铵膦按如下方法制备:以外消旋的草铵膦为原料,加入乙酸,10-60℃保温搅拌,加入乙酸酐,反应至溶液澄清透明,在80℃、0.075~0.085MPa条件下旋蒸除去乙酸,取浓缩物用水溶解,并用氢氧化钠水溶液调至中性,加入乙醇静置析出晶体,干燥,获得外消旋N-乙酰草铵膦;

所述乙酸与外消旋的草铵膦重量比20~30:1,所述乙酸酐与外消旋的草铵膦重量比为0.7~1.5:1。

5.如权利要求1所述化学-酶法生产草铵膦的方法,其特征在于所述催化剂按如下方法制备:(1)湿菌体:将含羧肽酶基因的工程菌接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,

37℃培养过夜,再以体积浓度1%接种量接种到含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,37℃、150rpm培养至菌体浓度OD600至0.4-0.8,加入终浓度为0.1mM的IPTG,28℃诱导培养12h后,4℃、8000rpm离心10min,收集湿菌体;(2)纯酶:将步骤(1)湿菌体悬浮于20mM、pH 8.0的Tris-HCl缓冲液中,振荡摇匀后超声波破碎15min,破碎液于12,000rpm离心10min去除细胞碎片,收集上清液;将上清液进行Ni-NTA柱层析,先用上样平衡缓冲液平衡Ni-NTA柱后,以

1.5mL/min的速率上样上清液,用上样平衡缓冲液洗脱以除去未吸附的蛋白,最后用洗脱缓冲液洗脱收集目标蛋白,目标蛋白在20mM、pH 8.5的Tris-HCl中透析,取截留液即为纯酶;

所述上样平衡缓冲液为含500mM NaCl和20mM咪唑的20mM Tris-HCl,pH 8.5;所述洗脱缓冲液为含500mM NaCl和500mM咪唑的20mM Tris-HCl,pH 8.5。

6.如权利要求1所述化学-酶法生产草铵膦的方法,其特征在于所述反应液分离纯化的方法为:反应完全后,将反应液离心,取上清液调节pH值至2,抽滤,取滤液上样至氢型001x7阳离子树脂,离子交换柱柱高比15:1,上样流速为1.0BV/h,上样后用超纯水冲洗4BV,收集含有未反应底物D-N-乙酰草铵膦流出液,将D-N-乙酰草铵膦消旋化后用于循环拆分;再用

2mol/L氨水以0.5BV/h流速洗脱,收集含有L-草铵膦的洗脱液,将洗脱液在60℃,真空度

0.075~0.085MPa下,减压浓缩,结晶得到L-草铵膦。

7.如权利要求6所述化学-酶法生产草铵膦的方法,其特征在于所述D-N-乙酰草铵膦消旋化方法为:将含D-N-乙酰草铵膦流出液减压蒸干,加入乙酸混合,再加入乙酸酐,在100-

125℃搅拌消旋反应,反应结束后将反应液减压蒸干,获得外消旋N-乙酰草铵膦,用于循环拆分;所述乙酸酐与D-N-乙酰草铵膦质量比为0.1~3:1,乙酸与D-N-乙酰草铵膦质量比为

10~20:1。