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专利号: 2018103936172
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-12-11
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种固定化腈基水合酶的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:

步骤(1)多糖-碳纳米管复合材料的制备:

首先将碳纳米管与混酸超声处理0.5~2小时后,加热回流10~14小时反应,得到羧基化碳纳米管;再将羧基化碳纳米管分散于氯化亚砜中,在有机碱的催化下超声处理0.5~2小时后,加热回流20~28小时进行氯代反应,得到酰氯化碳纳米管;最后酰氯化碳纳米管与多糖在有机胺的存在下,于有机溶剂A中超声处理0.5~2小时后,再在80-100℃下进行酯化反应24-96小时,将多糖修饰于碳纳米管上,离心分离得到多糖-碳纳米管复合材料;

步骤(2)固定化腈基水合酶的制备:

采用多糖-碳纳米管复合材料与腈基水合酶在pH为6.0-7.0的磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲溶液中,10℃~35℃超声处理0.5~2小时后,再搅拌36~60小时进行固定化,制备固定化腈基水合酶。

2.根据权利要求1所述的固定化腈基水合酶的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,所述的混酸为由体积比2~4:1的浓硫酸和浓硝酸组成,浓硫酸的质量百分数为93%~98.5%,浓硝酸的质量百分数为63%~73%,混酸体积用量以碳纳米管的质量计为1-3mL/g。

3.根据权利要求1所述的固定化腈基水合酶的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,所述的有机碱为N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N,N-二乙基甲酰胺、N,N-二乙基乙酰胺中的一种或两种以上,有机碱的质量用量为羧基化碳纳米管的质量的5%-10%g/g;

所述的氯化亚砜的质量用量为羧基化碳纳米管质量的5-10倍g/g。

4.根据权利要求1所述的固定化腈基水合酶的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,所述的多糖为环糊精、壳聚糖、甲基纤维素、乙基纤维素、海藻酸或葡聚糖,多糖的质量用量为羧基化碳纳米管质量的3-8倍g/g;

所述的有机胺为三乙胺、二甲氨基吡啶、N,N-二异丙基乙胺、N-甲基吗啉或者DBU,其质量用量为羧基化碳纳米管质量的2-4倍g/g。

5.根据权利要求1所述的固定化腈基水合酶的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,所述的有机溶剂A为N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、2-甲基四氢呋喃、二恶烷中的一种或两种以上,其体积用量以羧基化碳纳米管质量计为30-35mL/g;

所述的离心分离的速率为7000r/min~9000r/min。

6.根据权利要求1所述的固定化腈基水合酶的制备方法,其特征在于,步骤(2)中,所述的磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲溶液的体积用量以多糖-碳纳米管复合材料质量计为20-

25mL/g;

所述的多糖-碳纳米管复合材料与腈基水合酶重量比为35-55:1。

7.一种(S)-N-乙基吡咯烷-2-甲酰胺的制备方法,包括以下步骤:

(a)采用权利要求1~6任一项所述的制备方法制备的固定化腈基水合酶;

(b)以固定化腈基水合酶为催化剂,以2-氰基-N-乙基吡咯烷为底物,以pH为6.0-7.0的磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲溶液为反应介质,加入有机溶剂B,在20-40℃下,搅拌反应12-24小时,反应完全后,得(S)-N-乙基吡咯烷-2-甲酰胺和(R)-N-乙基吡咯烷-2-羧酸混合液,将混合液分离纯化得(S)-N-乙基吡咯烷-2-甲酰胺。

8.根据权利要求7所述的(S)-N-乙基吡咯烷-2-甲酰胺的制备方法,其特征在于,步骤(b)中,所述的固定化氰基水合酶的加入量为2-氰基-N-乙基吡咯烷质量的1%-10%g/g,所述的固定化氰基水合酶的酶活19000-31000U/g;

所述的磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲溶液体积用量以2-氰基-N-乙基吡咯烷质量计为

100-150mL/g;

所述的有机溶剂B为N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙醇、异丙醇,其体积用量是磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲溶液体积用量的5%-10%mL/mL。

9.根据权利要求7所述的(S)-N-乙基吡咯烷-2-甲酰胺的制备方法,其特征在于,步骤(b)中,所述的混合液分离纯化包括:加入有机溶剂C进行萃取三次,合并有机层,无水硫酸钠干燥,过滤,减压蒸干得(S)-N-乙基吡咯烷-2-甲酰胺。

10.根据权利要求9所述的(S)-N-乙基吡咯烷-2-甲酰胺的制备方法,其特征在于,所述的有机溶剂C为乙酸乙酯、乙酸丁酯、二氯甲烷或者二氯乙烷。